Infekce způsobené ESbL-produkujícími Enterobacteriaceae v Itálii

VÝZKUMNÝ PLÁN A METODIKA

Populace Všichni pacienti s infekcemi (tj. bakteriémie, pneumonie, břišní infekce, kožní infekce a infekce močových cest) způsobené Enterobacteriaceae produkujícími ESBL.

Kritéria vyloučení Děti < 16 let

Design studie Multicentrická prospektivní kohortová studie. Pacienti odpovídající definici studie budou detekováni denní kontrolou mikrobiologických databází jedním specializovaným lékařem. Epidemiologické proměnné budou detekovány u všech pacientů při přijetí do studie. K identifikaci rizikových faktorů infekcí (např. bakteriémie, pneumonie, břišní infekce, kožní infekce a infekce močových cest) způsobené Enterobacteriaceae produkujícími ESBL bude provedena případová kontrolní studie. Případový pacient bude definován jako dospělý pacient (≥ 16 let), který má infekci způsobenou Enterobacteriaceae produkující ESBL podle definic Centra pro kontrolu a prevenci nemocí v Atlantě (CDC). V Laboratořích klinické mikrobiologie bude definice produkce ESBL v Laboratořích klinické mikrobiologie podle pokynů CLSI (3) nebo podle pokynů BSAC (http://www.bsac.org.uk) pro jiné druhy než Klebsiella spp. E. coli a Proteus mirabilis. Pro každý případ bude vybrán jeden ovládací prvek. Kontrola bude vybrána ze všech dospělých pacientů přijatých do stejné nemocnice během stejného období (do 30 dnů) a u kterých nebyly během pobytu v nemocnici izolovány Enterobacteriaceae produkující ESBL. Pokud bude pro jeden případ k dispozici více než jedna kontrola, budou vybráni pacienti s datem a časem přijetí, které je nejblíže danému případu.

K identifikaci rizikových faktorů úmrtnosti bude provedena druhá případová kontrolní studie srovnávající infikované pacienty, kteří zemřeli, s infikovanými pacienty, kteří přežili (hodnotitelné pouze u pacientů s bakteriémií, infekcemi ran, zápalem plic a meningitidou). Tato analýza bude provedena s úpravou výsledků pro neadekvátní empirickou antimikrobiální terapii a místo infekce (viz následující definice).

Sběr dat Budou revidovány lékařské záznamy o přijetí na lůžko a mikrobiologické a lékárenské databáze. Údaje shromážděné při zápisu do studie budou zahrnovat: demografii pacienta, převoz z jiné nemocnice, rezidenta dlouhodobého zařízení nebo pečovatelského domu, předchozí hospitalizaci do jednoho roku, ambulantní stav, požadavek na chronickou hemodialýzu, přítomnost centrálního žilního katétru (CVC) a pobyt na JIP a chirurgické zákroky během 30 dnů před zařazením do studie. Složené skóre komorbidních onemocnění bude odvozeno pomocí Charlsonova skóre. Závažnost onemocnění při prezentaci bude kvantifikována pomocí kritérií McCabeho a Jacksona. Antibiotika podávaná během 30denního období před zařazením do studie a po dobu alespoň 48 hodin budou zaznamenána. Pro analýzu rizikových faktorů bude orální a intravenózní expozice antibiotik analyzována podle jednotlivých antibiotik a tříd a bude zahrnovat peniciliny, vankomycin, cefalosporiny, antibiotika s převážně anaerobní aktivitou (metronidazol a klindamycin), aminoglykosidy, chinolony a karbapenemy. Délka pobytu (LOS) po diagnóze infekce, management infekcí, načasování a typ antimikrobiální terapie, výsledky následných klinických kultivací (pokud existují), hematogenní komplikace a úmrtí budou také extrahovány ze zdravotnické dokumentace. Mikrobiologické záznamy budou také přezkoumány pro získání vankomycin rezistentních enterokoků (VRE) nebo meticilin-rezistentních S. aureus (MRSA) během 12 měsíců před zařazením do studie. Všichni pacienti s infekcemi způsobenými Enterobacteriaceae produkujícími ESBL budou sledováni až do propuštění z nemocnice nebo úmrtí.

Mortalita bude definována jako úmrtí, ke kterému dojde během studijní hospitalizace. Vhodná antimikrobiální terapie bude definována jako zahájení terapie s aktivitou proti Enterobacteriaceae produkujícím ESBL (podle výsledků vzorce antimikrobiální citlivosti izolátu) od předchozího dne do 2 dnů po počátečním pozitivním výsledku klinické kultivace.

Výsledky Primární výsledky

1. Rizikové faktory pro rozvoj infekcí způsobených bakteriemi produkujícími ESBL;
2. Rizikové faktory pro neadekvátní počáteční antimikrobiální léčbu;
3. Celková mortalita a 30denní mortalita u pacientů, kteří dostávali neadekvátní počáteční antimikrobiální léčbu (hodnotitelné pouze u pacientů s bakteriémií, abdominální infekcí a pneumonií);
4. Variabilita podle místa infekce celkové úmrtnosti a 30denní úmrtnosti u pacientů, kteří dostávali neadekvátní počáteční antimikrobiální terapii (hodnotitelné pouze u pacientů s bakteriémií, abdominální infekcí a pneumonií).

Sekundární výsledky

1. Délka hospitalizace;
2. Náklady na neadekvátní počáteční terapii;
3. Dny defervescence.

Statistická analýza Na konci studie budou provedeny dvě různé analýzy: první bude zvažovat pacienty s bakteriémií, abdominální infekcí a pneumonií a bude zaměřena na mortalitu; druhá analýza bude zvažovat všechny infikované pacienty a bude zaměřena na analýzu rizikových faktorů a sekundární výsledky.

Zdůvodnění velikosti vzorku Předpoklady

Pacienti s bakteriémií, zápalem plic, břišními infekcemi, kožními infekcemi a infekcemi močových cest (první analýza):

Mortalita mezi pacienty s neadekvátní počáteční terapií: 25 % Mortalita mezi pacienty s vhodnou počáteční terapií: 13 %

Všichni zahrnutí pacienti:

Procento bakteriémie: 20 % Procento zápalu plic: 10 % Procento břišních infekcí: 15 % Procento kožních infekcí: 3 % Procento infekcí močových cest: 52 %

Primární výsledky Rizikové faktory mortality Rozdíl mortality mezi kontrolami (nevhodná terapie) a případy (vhodná terapie): předpokládali jsme snížení z 25 % na 13 %.

Sekundární výsledky Rozdíl v délce hospitalizace mezi případy (vhodná terapie) a kontrolami (nevhodná terapie): předpokládali jsme pokles z 80 % (délka hospitalizace < 15 dní) na 40 %.

Rozdíl defervescence mezi případy (vhodná terapie) a kontrolami (nevhodná terapie): předpokládali jsme pokles z 85 % (defervescence < 3 dny) na 30 %.

Za předpokladu, že p1=p2, kde p1 je podíl v populaci 1 a p2 je podíl v populaci 2 a že alfa=0,05 (oboustranný), výkon=0,80.

Požadovaná velikost vzorku pro analýzu rizikových faktorů mortality: 366 pacientů s bakteriémií, infekcemi ran, zápalem plic a meningitidou. Při zahrnutí 366 pacientů s výše uvedenými infekcemi bude celková velikost vzorku pravděpodobně 813 pacientů infikovaných Enterobacteriaceae produkujícími ESBL.

Mikrobiologická analýza bakteriálních kmenů

Všechny izoláty produkující ESBL získané od pacientů zařazených do studie v laboratořích klinické mikrobiologie každého klinického centra budou shromážděny a podrobeny dalšímu zkoumání, včetně:

• potvrzení identifikace na úrovni druhu;
• stanovení profilu antimikrobiální rezistence vůči standardnímu souboru léků;
• analýza determinant ESBL;
• analýza klonálního vztahu mezi bakteriálními izoláty stejného druhu. Výsledky mikrobiologické analýzy budou použity pro korelaci s klinickými údaji pro posouzení epidemiologického a klinického dopadu kmenů produkujících ESBL.

Experimentální metodologie

Potvrzení identifikace bakteriálních izolátů na úrovni druhu bude provedeno standardními fenotypovými metodami (10). V případě nejednoznačnosti výsledků bude identifikace potvrzena sekvenováním 16S rDNA (16).

Testování antimikrobiální citlivosti bude provedeno mikroředěním bujónu podle doporučení CLSI (3) a kategorické přiřazení bude provedeno pomocí CLSI breakpointů (3). Budou zahrnuty následující látky: ertapenem, imipenem, meropenem, cefepim, ceftazidim, cefotaxim, piperacilin/tazobaktam, amoxicilin/klavulanát, ciprofloxacin, levofloxacin, gentamicin, amikacin.

Povaha determinant ESBL bude zkoumána molekulární analýzou pomocí PCR a sekvenováním, jak bylo popsáno dříve (9, 15). Přítomnost ESBL determinantů typu TEM-, SHV, CTX-M- a PER (tj. E. ty, o kterých je známo, že jsou v oběhu v Itálii (9, 15)), budou prošetřeny. V případě negativních výsledků s dostupnými sondami bude ESBL fenotyp znovu potvrzen a pokud je pozitivní, povaha -laktamázových deerminantů bude studována pomocí: (i) analytické izoelektrické fokusace (IEF) na surové extrakty za použití výše popsaných způsoby (14); (ii) Technologie DNA microarray využívající microarray pro geny β-laktamázy, která byla vyvinuta v naší laboratoři, která zahrnuje sondy pro neobvyklé geny ESBL, jako jsou enzymy VEB, GES, BES, SFO a TLA. V případě nových genů ESBL nedetekovaných výše uvedenými metodami (nepravděpodobný výskyt), V případě produkce ESBL, ale nevysvětlené přítomností známých determinant rezistence, budou determinanty rezistence studovány pomocí brokovnicového klonování. mapováním a sekvenováním.

Klonální příbuznost mezi izoláty stejného druhu bude zkoumána pomocí vysoce výkonných genotypizačních technik, jako je RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) a/nebo analýzou AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) a/nebo REP PCR (19-21). U vybraných izolátů budou klonální vztahy provedeny makrorestrikční analýzou genomové DNA pomocí gelové elektroforézy v pulzním poli (PFGE).

Ve vybraných případech bude zvážena analýza plazmidu a zkoumání determinant rezistence k neβ-laktamovým látkám (molekulárními technikami), pokud by tyto informace byly relevantní pro korelaci s klinickými a epidemiologickými údaji.