Infecties veroorzaakt door ESbL-producerende Enterobacteriaceae in Italië

ONDERZOEKSPLAN EN METHODOLOGIE

Populatie Alle patiënten met infecties (d.w.z. bacteriëmie, longontsteking, buikinfecties, huidinfecties en urineweginfecties) veroorzaakt door ESBL-producerende Enterobacteriaceae.

Uitsluitingscriteria Kinderen < 16 jaar

Proefopzet Multicenter prospectieve cohortstudie. Patiënten die overeenkomen met de onderzoeksdefinitie zullen worden opgespoord door dagelijkse inspectie van microbiologische databases door één toegewijde arts. Bij opname in het onderzoek zullen voor alle patiënten epidemiologische variabelen worden gedetecteerd. Om de risicofactoren voor infecties te identificeren (d.w.z. bacteriëmie, longontsteking, buikinfecties, huidinfecties en urineweginfecties) veroorzaakt door ESBL-producerende Enterobacteriaceae zal een patiënt-controleonderzoek worden uitgevoerd. Een casuspatiënt wordt gedefinieerd als een volwassen patiënt ( 16 jaar) die een infectie heeft veroorzaakt door ESBL-producerende Enterobacteriaceae volgens de definities van het Center for Diseases Control and Prevention in Atlanta (CDC). In de Clinical Microbiology Laboratories zal de definitie van ESBL-productie door de Clinical Microbiology Laboratories zijn volgens de CLSI-richtlijnen (3), of volgens de BSAC-richtlijnen (http://www.bsac.org.uk) voor andere soorten dan Klebsiella spp. ., E. coli en Proteus mirabilis. Voor elk geval wordt één controle geselecteerd. De controlegroep zal worden gekozen uit alle volwassen patiënten die in dezelfde periode (binnen 30 dagen) in hetzelfde ziekenhuis zijn opgenomen en bij wie ESBL-producerende Enterobacteriaceae niet zijn geïsoleerd tijdens hun verblijf in het ziekenhuis. Als er per casus meer dan één controle beschikbaar is, worden patiënten gekozen waarvan de datum en het tijdstip van opname het dichtst bij de casus liggen.

Om de risicofactoren voor mortaliteit te identificeren, zal een tweede case-control studie worden uitgevoerd waarbij geïnfecteerde patiënten die zijn overleden, worden vergeleken met geïnfecteerde patiënten die het hebben overleefd (alleen te evalueren bij patiënten met bacteriëmie, wondinfecties, longontsteking en meningitis). Deze analyse zal worden uitgevoerd met aanpassing van de resultaten voor ontoereikende empirische antimicrobiële therapie en plaats van infectie (zie volgende definities).

Gegevensverzameling Medische dossiers van intramurale opnames en microbiologie- en apotheekdatabases zullen worden beoordeeld. Gegevens die worden verzameld bij de studie-inschrijving omvatten: demografische gegevens van de patiënt, overplaatsing van een ander ziekenhuis, bewoner van een instelling voor langdurige zorg of verpleeghuis, eerdere ziekenhuisopname binnen een jaar, ambulante status, vereiste voor chronische hemodialyse, aanwezigheid van een centraal veneuze katheter (CVC) , en IC-verblijf en chirurgische ingrepen in de 30 dagen voorafgaand aan opname in het onderzoek. Een samengestelde score van comorbide ziekten zal worden afgeleid met behulp van de Charlson-score. De ernst van de ziekte bij presentatie zal worden gekwantificeerd met behulp van de criteria van McCabe en Jackson. Antibiotica toegediend gedurende een periode van 30 dagen voorafgaand aan de inschrijving voor het onderzoek en gedurende ten minste 48 uur worden geregistreerd. Voor de analyse van de risicofactoren zal de blootstelling aan orale en intraveneuze antibiotica worden geanalyseerd per individuele antibiotica en per klasse, waaronder penicillines, vancomycine, cefalosporines, antibiotica met overwegend anaërobe activiteit (metronidazol en clindamycine), aminoglycosiden, chinolonen en carbapenems. Duur van het verblijf (LOS) na infectiediagnose, beheer van infecties, timing en type antimicrobiële therapie, resultaten van follow-up klinische kweken (indien aanwezig), hematogene complicaties en overlijden zullen ook uit medische dossiers worden gehaald. Microbiologische dossiers zullen ook worden beoordeeld op herstel van vancomycine-resistente enterokokken (VRE) of methicilline-resistente S. aureus (MRSA) in de 12 maanden voorafgaand aan de studie-inschrijving. Alle patiënten met infecties veroorzaakt door ESBL-producerende Enterobacteriaceae zullen worden gevolgd tot aan ontslag uit het ziekenhuis of overlijden.

Sterfte zal worden gedefinieerd als overlijden tijdens de ziekenhuisopname van de studie. Geschikte antimicrobiële therapie wordt gedefinieerd als het starten van een therapie met activiteit tegen de ESBL-producerende Enterobacteriaceae (volgens de resultaten van het antimicrobiële gevoeligheidspatroon van het isolaat) vanaf de dag vóór tot 2 dagen na het eerste positieve klinische kweekresultaat.

Uitkomsten Primaire uitkomsten

1. Risicofactoren voor het ontstaan ​​van infecties veroorzaakt door ESBL-producerende bacteriën;
2. Risicofactoren voor ontoereikende initiële antimicrobiële therapie;
3. Totale mortaliteit en mortaliteit na 30 dagen bij patiënten die onvoldoende initiële antimicrobiële therapie kregen (alleen te evalueren bij patiënten met bacteriëmie, abdominale infecties en longontsteking);
4. Variabiliteit per plaats van infectie van totale mortaliteit en mortaliteit na 30 dagen bij patiënten die onvoldoende initiële antimicrobiële therapie kregen (alleen te evalueren bij patiënten met bacteriëmie, abdominale infecties en longontsteking).

Secundaire uitkomsten

1. Duur van ziekenhuisopname;
2. Kosten van ontoereikende initiële therapie;
3. Dagen van uitstel.

Statistische analyse Aan het einde van het onderzoek zullen twee verschillende analyses worden uitgevoerd: de eerste zal patiënten met bacteriëmie, abdominale infecties en longontsteking in overweging nemen, en zal gericht zijn op mortaliteit; de tweede analyse zal alle geïnfecteerde patiënten in overweging nemen en zal gericht zijn op risicofactoranalyse en secundaire uitkomsten.

Verantwoording steekproefomvang Aannames

Patiënten met bacteriëmie, longontsteking, buikinfecties, huidinfecties en urineweginfecties (eerste analyse):

Sterfte onder patiënten met een ontoereikende initiële therapie: 25% Sterfte onder patiënten met een geschikte initiële therapie: 13%

Alle opgenomen patiënten:

Percentage bacteriëmie: 20% Percentage longontsteking: 10% Percentage buikinfecties: 15% Percentage huidinfecties: 3% Percentage urineweginfecties: 52%

Primaire uitkomsten Risicofactoren voor mortaliteit Verschil in mortaliteit tussen controles (ongepaste therapie) en gevallen (juiste therapie): we verwachtten een reductie van 25% naar 13%.

Secundaire uitkomsten Verschil in opnameduur tussen patiënten (passende therapie) en controles (ongepaste therapie): we verwachtten een daling van 80% (opnameduur < 15 dagen) naar 40%.

Verschil in uitstel tussen gevallen (aangepaste therapie) en controles (onaangepaste therapie): we verwachtten een afname van 85% (uitstel < 3 dagen) tot 30%.

Ervan uitgaande dat p1=p2, waarbij p1 de proportie in populatie 1 is en p2 de proportie in populatie 2 is en dat alfa=0,05 (tweezijdig), vermogen=0,80.

Vereiste steekproefomvang voor analyse van risicofactoren voor mortaliteit: 366 patiënten met bacteriëmie, wondinfecties, longontsteking en meningitis. Om 366 patiënten met de hierboven gerapporteerde infecties op te nemen, is de totale steekproefomvang waarschijnlijk 813 patiënten die zijn geïnfecteerd met ESBL-producerende Enterobacteriaceae.

Microbiologische analyse van bacteriestammen

Alle ESBL-producerende isolaten verkregen van patiënten die deelnamen aan de studie in de Klinische Microbiologische Laboratoria van elk Klinisch Centrum zullen worden verzameld en onderworpen aan verder onderzoek, waaronder:

• bevestiging van de determinatie op soortniveau;
• bepaling van het antimicrobiële resistentieprofiel tegen een standaardset geneesmiddelen;
• analyse van de ESBL-determinanten;
• analyse van de klonale relatie tussen bacteriële isolaten van dezelfde soort. Resultaten van microbiologische analyse zullen worden gebruikt voor correlatie met klinische gegevens om de epidemiologische en klinische impact van de ESBL-producerende stammen te beoordelen.

Experimentele methodologie

Bevestiging van de identificatie van de bacteriële isolaten op soortniveau zal worden uitgevoerd met standaard fenotypische methoden (10). In geval van dubbelzinnigheid van de resultaten, wordt de identificatie bevestigd door 16S rDNA-sequencing (16).

Antimicrobiële gevoeligheidstests zullen worden uitgevoerd door microdilutie met bouillon zoals aanbevolen door de CLSI (3), en categorische toewijzing zal worden uitgevoerd met behulp van de CLSI-breekpunten (3). De volgende middelen zullen worden opgenomen: ertapenem, imipenem, meropenem, cefepime, ceftazidim, cefotaxim, piperacilline/tazobactam, amoxicilline/clavulanaat, ciprofloxacine, levofloxacine, gentamicine, amikacine.

De aard van de ESBL-determinanten zal worden onderzocht door middel van moleculaire analyse met behulp van PCR en sequencing, zoals eerder beschreven (9, 15). De aanwezigheid van ESBL-determinanten van het TEM-, SHV-, CTX-M- en PER-type (i. e. die waarvan bekend is dat ze in Italië circuleren (9, 15)) zullen worden onderzocht. In het geval van negatieve resultaten met de beschikbare sondes, zal het ESBL-fenotype opnieuw worden bevestigd en, indien positief, zal de aard van -lactamase-determinanten worden bestudeerd door middel van: (i) analytische iso-elektrische focussering (IEF) op ruwe extracten met behulp van eerder beschreven methoden (14); (ii) DNA-microarray-technologie, waarbij gebruik wordt gemaakt van een microarray voor β-lactamase-genen die is ontwikkeld in ons laboratorium, waaronder probes voor ongebruikelijke ESBL-genen zoals VEB-, GES-, BES-, SFO- en TLA-enzymen. In het geval van nieuwe ESBL-genen die niet worden gedetecteerd door de bovenstaande methoden (een onwaarschijnlijke gebeurtenis), in het geval van productie van ESBL maar niet verklaard door de aanwezigheid van bekende resistentiedeterminanten, zullen de resistentiedeterminanten worden bestudeerd door middel van een shotgun-kloneringsbenadering gevolgd door mapping en sequencing.

Klonale verwantschap tussen isolaten van dezelfde soort zal worden onderzocht door high-throughput genotyperingstechnieken zoals RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) en/of door AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) analyse en/of REP PCR (19-21). In geselecteerde isolaten zullen de klonale relaties worden uitgevoerd door middel van macrorestrictieanalyse van genomisch DNA door pulsed-field gelelektroforese (PFGE).

Plasmide-analyse en onderzoek van resistentiedeterminanten voor niet-β-lactammiddelen (door middel van moleculaire technieken) zullen in geselecteerde gevallen worden overwogen, indien deze informatie relevant is voor correlatie met klinische en epidemiologische gegevens.