Infezioni da Enterobacteriaceae produttrici di ESbL in Italia

PIANO E METODOLOGIA DELLA RICERCA

Popolazione Tutti i pazienti con infezioni (es. batteriemia, polmonite, infezioni addominali, infezioni della pelle e infezioni del tratto urinario) causate da Enterobacteriaceae produttrici di ESBL.

Criteri di esclusione Bambini < 16 anni

Disegno dello studio Studio di coorte prospettico multicentrico. I pazienti corrispondenti alla definizione dello studio saranno rilevati mediante ispezione giornaliera dei database microbiologici da parte di un medico dedicato. Le variabili epidemiologiche saranno rilevate per tutti i pazienti all'ammissione allo studio. Identificare i fattori di rischio per le infezioni (es. batteriemia, polmonite, infezioni addominali, infezioni della pelle e infezioni del tratto urinario) causate da Enterobacteriaceae produttrici di ESBL sarà condotto uno studio caso-controllo. Un paziente caso sarà definito come paziente adulto ( 16 anni di età) che ha un'infezione causata da Enterobacteriaceae produttrici di ESBL secondo le definizioni del Center for Diseases Control and Prevention di Atlanta (CDC). Nei laboratori di microbiologia clinica, la definizione della produzione di ESBL da parte dei laboratori di microbiologia clinica sarà conforme alle linee guida CLSI (3), o alle linee guida BSAC (http://www.bsac.org.uk) per le specie diverse da Klebsiella spp ., E. coli e Proteus mirabilis. Verrà selezionato un controllo per ogni caso. Il controllo sarà scelto tra tutti i pazienti adulti ricoverati nello stesso ospedale durante lo stesso periodo (entro 30 giorni) e nei quali Enterobacteriaceae produttrici di ESBL non sono state isolate durante la loro degenza ospedaliera. Se sarà disponibile più di un controllo per caso, verranno scelti i pazienti con la data e l'ora di ricovero più vicine al caso.

Per identificare i fattori di rischio per la mortalità verrà eseguito un secondo studio caso-controllo confrontando pazienti infetti deceduti con pazienti infetti sopravvissuti (valutabile solo in pazienti con batteriemia, infezioni della ferita, polmonite e meningite). Questa analisi verrà eseguita correggendo i risultati per terapia antimicrobica empirica inadeguata e sito di infezione (vedere le seguenti definizioni).

Raccolta dei dati Saranno esaminate le cartelle cliniche dei ricoveri ospedalieri e le banche dati microbiologiche e farmaceutiche. I dati raccolti all'arruolamento nello studio includeranno: dati anagrafici del paziente, trasferimento da un altro ospedale, residente in una struttura a lungo termine o casa di cura, precedente ricovero entro un anno, stato ambulatoriale, necessità di emodialisi cronica, presenza di un catetere venoso centrale (CVC) , e degenza in terapia intensiva e procedure chirurgiche nei 30 giorni precedenti l'inclusione nello studio. Un punteggio composito delle malattie in comorbilità sarà derivato utilizzando il punteggio di Charlson. La gravità della malattia alla presentazione sarà quantificata utilizzando i criteri di McCabe e Jackson. Saranno registrati gli antibiotici somministrati durante un periodo di 30 giorni prima dell'arruolamento nello studio e per almeno 48 ore. Per l'analisi dei fattori di rischio, l'esposizione agli antibiotici per via orale ed endovenosa sarà analizzata per singoli antibiotici e per classi e includerà penicilline, vancomicina, cefalosporine, antibiotici con attività prevalentemente anaerobica (metronidazolo e clindamicina), aminoglicosidi, chinoloni e carbapenemi. Dalle cartelle cliniche saranno estratti anche la durata della degenza (LOS) dopo la diagnosi dell'infezione, la gestione delle infezioni, i tempi e il tipo di terapia antimicrobica, i risultati delle colture cliniche di follow-up (se presenti), le complicanze ematogene e la morte. Verranno inoltre esaminate le registrazioni microbiologiche per il recupero di enterococchi resistenti alla vancomicina (VRE) o S. aureus resistente alla meticillina (MRSA) nei 12 mesi precedenti l'arruolamento nello studio. Tutti i pazienti con infezioni causate da Enterobacteriaceae produttrici di ESBL saranno seguiti fino alla dimissione dall'ospedale o al decesso.

La mortalità sarà definita come la morte avvenuta durante il ricovero dello studio. La terapia antimicrobica appropriata sarà definita come l'inizio della terapia con attività contro le Enterobacteriaceae produttrici di ESBL (in base ai risultati del modello di suscettibilità antimicrobica dell'isolato) dal giorno prima a 2 giorni dopo il risultato iniziale della coltura clinica positiva.

Risultati Risultati primari

1. Fattori di rischio per lo sviluppo di infezioni causate da batteri produttori di ESBL;
2. Fattori di rischio per terapia antimicrobica iniziale inadeguata;
3. Mortalità complessiva e mortalità a 30 giorni tra i pazienti che ricevono una terapia antimicrobica iniziale inadeguata (valutabile solo nei pazienti con batteriemia, infezioni addominali e polmonite);
4. Variabilità per sede di infezione della mortalità complessiva e della mortalità a 30 giorni tra i pazienti che ricevono una terapia antimicrobica iniziale inadeguata (valutabile solo nei pazienti con batteriemia, infezioni addominali e polmonite).

Esiti secondari

1. Durata del ricovero;
2. Costi di una terapia iniziale inadeguata;
3. Giorni di defervescenza.

Analisi statistica Al termine dello studio verranno effettuate due diverse analisi: la prima prenderà in considerazione i pazienti con batteriemia, infezioni addominali e polmonite, e si concentrerà sulla mortalità; la seconda analisi prenderà in considerazione tutti i pazienti infetti e si concentrerà sull'analisi dei fattori di rischio e sugli esiti secondari.

Giustificazione della dimensione del campione Presupposti

Pazienti con batteriemia, polmonite, infezioni addominali, infezioni della pelle e infezioni del tratto urinario (prima analisi):

Mortalità tra i pazienti con terapia iniziale inadeguata: 25% Mortalità tra i pazienti con terapia iniziale appropriata: 13%

Tutti i pazienti inclusi:

Percentuale di batteriemia: 20% Percentuale di polmonite: 10% Percentuale di infezioni addominali: 15% Percentuale di infezioni cutanee: 3% Percentuale di infezioni delle vie urinarie: 52%

Risultati primari Fattori di rischio per la mortalità Differenza di mortalità tra controlli (terapia inappropriata) e casi (terapia appropriata): abbiamo previsto una riduzione dal 25% al ​​13%.

Risultati secondari Differenza di durata del ricovero tra casi (terapia appropriata) e controlli (terapia inappropriata): abbiamo previsto una diminuzione dall'80% (durata del ricovero < 15 giorni) al 40%.

Differenza di defervescenza tra casi (terapia appropriata) e controlli (terapia inappropriata): abbiamo previsto una diminuzione dall'85% (defervescenza < 3 giorni) al 30%.

Supponendo che p1=p2, dove p1 è la proporzione nella popolazione 1 e p2 è la proporzione nella popolazione 2 e che alpha=0.05 (bilaterale), potenza=0,80.

Dimensione del campione richiesta per l'analisi dei fattori di rischio per la mortalità: 366 pazienti con batteriemia, infezioni della ferita, polmonite e meningite. Per includere 366 pazienti con le suddette infezioni riportate, è probabile che la dimensione totale del campione sia di 813 pazienti infetti da Enterobacteriaceae produttrici di ESBL.

Analisi microbiologiche di ceppi batterici

Tutti gli isolati produttori di ESBL ottenuti dai pazienti inclusi nello studio presso i laboratori di microbiologia clinica di ciascun centro clinico saranno raccolti e sottoposti a ulteriori indagini tra cui:

• conferma dell'identificazione a livello di specie;
• determinazione del profilo di resistenza antimicrobica rispetto a un set standard di farmaci;
• analisi dei determinanti ESBL;
• analisi della relazione clonale tra isolati batterici della stessa specie. I risultati dell'analisi microbiologica saranno utilizzati per la correlazione con i dati clinici per valutare l'impatto epidemiologico e clinico dei ceppi produttori di ESBL.

Metodologia sperimentale

La conferma dell'identificazione degli isolati batterici a livello di specie sarà effettuata mediante metodi fenotipici standard (10). In caso di ambiguità dei risultati, l'identificazione sarà confermata dal sequenziamento del 16S rDNA (16).

I test di sensibilità antimicrobica saranno eseguiti mediante microdiluizione del brodo come raccomandato dal CLSI (3) e l'assegnazione per categoria sarà effettuata utilizzando i breakpoint CLSI (3). Saranno inclusi i seguenti agenti: ertapenem, imipenem, meropenem, cefepime, ceftazidime, cefotaxime, piperacillina/tazobactam, amoxicillina/clavulanato, ciprofloxacina, levofloxacina, gentamicina, amikacina.

La natura dei determinanti ESBL sarà studiata mediante analisi molecolare mediante PCR e sequenziamento, come descritto in precedenza (9, 15). La presenza di determinanti ESBL di tipo TEM, SHV, CTX-M e PER (i. e. quelli notoriamente circolanti in Italia (9, 15) saranno indagati. In caso di risultati negativi con le sonde disponibili, il fenotipo ESBL sarà riconfermato e, se positivo, la natura dei deerminanti -lattamasi sarà studiata mediante: (i) Focalizzazione isoelettrica analitica (IEF) su estratti grezzi utilizzando metodi (14); (ii) tecnologia del DNA microarray, utilizzando un microarray per i geni della β-lattamasi che è stato sviluppato nel nostro laboratorio, che include sonde per geni ESBL non comuni come gli enzimi VEB, GES, BES, SFO e TLA. In caso di nuovi geni ESBL non rilevati dai metodi di cui sopra (un evento improbabile), In caso di produzione di ESBL ma non spiegata dalla presenza di determinanti di resistenza noti, i determinanti di resistenza saranno studiati mediante un approccio di clonazione del fucile seguito mediante mappatura e sequenziamento.

La parentela clonale tra isolati della stessa specie sarà studiata mediante tecniche di genotipizzazione high-throughput quali analisi RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e/o AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) e/o REP PCR (19-21). In isolati selezionati, le relazioni clonali saranno eseguite mediante analisi di macrorestrizione del DNA genomico mediante elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE).

L'analisi dei plasmidi e lo studio dei determinanti della resistenza agli agenti non β-lattamici (mediante tecniche molecolari) saranno presi in considerazione in casi selezionati, qualora queste informazioni siano rilevanti per la correlazione con i dati clinici ed epidemiologici.