Infektionen durch ESbL-produzierende Enterobacteriaceae in Italien

FORSCHUNGSPLAN UND METHODIK

Population Alle Patienten mit Infektionen (d. h. Bakteriämie, Lungenentzündung, Bauchinfektionen, Hautinfektionen und Harnwegsinfektionen), die durch ESBL-produzierende Enterobacteriaceae verursacht werden.

Ausschlusskriterien Kinder < 16 Jahre

Studiendesign Multizentrische prospektive Kohortenstudie. Patienten, die der Studiendefinition entsprechen, werden durch tägliche Überprüfung mikrobiologischer Datenbanken durch einen dedizierten Arzt ermittelt. Epidemiologische Variablen werden für alle Patienten bei Studienaufnahme erfasst. Um die Risikofaktoren für Infektionen zu identifizieren (z. Bakteriämie, Lungenentzündung, Bauchinfektionen, Hautinfektionen und Harnwegsinfektionen), die durch ESBL-produzierende Enterobacteriaceae verursacht werden, wird eine Fall-Kontroll-Studie durchgeführt. Ein Fallpatient wird als erwachsener Patient (≥ 16 Jahre) definiert, der eine durch ESBL-produzierende Enterobacteriaceae verursachte Infektion gemäß den Definitionen des Center for Diseases Control and Prevention in Atlanta (CDC) hat. In den Clinical Microbiology Laboratories erfolgt die Definition der ESBL-Produktion durch die Clinical Microbiology Laboratories gemäß den CLSI-Richtlinien (3) oder den BSAC-Richtlinien (http://www.bsac.org.uk) für andere Arten als Klebsiella spp ., E. coli und Proteus mirabilis. Für jeden Fall wird eine Kontrolle ausgewählt. Die Kontrollgruppe wird unter allen erwachsenen Patienten ausgewählt, die im selben Zeitraum (innerhalb von 30 Tagen) in dasselbe Krankenhaus eingeliefert wurden und bei denen während ihres Krankenhausaufenthalts keine ESBL-produzierenden Enterobacteriaceae isoliert wurden. Wenn pro Fall mehr als eine Kontrolle verfügbar ist, werden Patienten ausgewählt, deren Datum und Uhrzeit der Aufnahme dem Fall am nächsten kommen.

Um die Risikofaktoren für Mortalität zu identifizieren, wird eine zweite Fall-Kontroll-Studie durchgeführt, in der infizierte Patienten, die gestorben sind, mit infizierten Patienten verglichen werden, die überlebt haben (auswertbar nur bei Patienten mit Bakteriämie, Wundinfektionen, Lungenentzündung und Meningitis). Diese Analyse wird durchgeführt, indem die Ergebnisse für eine unzureichende empirische antimikrobielle Therapie und den Infektionsort angepasst werden (siehe folgende Definitionen).

Datenerhebung Krankenakten von stationären Patientenaufnahmen sowie mikrobiologische und pharmazeutische Datenbanken werden gesichtet. Zu den bei der Studieneinschreibung erhobenen Daten gehören: Demografische Daten des Patienten, Verlegung aus einem anderen Krankenhaus, Bewohner einer Langzeiteinrichtung oder eines Pflegeheims, früherer Krankenhausaufenthalt innerhalb eines Jahres, ambulanter Status, Notwendigkeit einer chronischen Hämodialyse, Vorhandensein eines zentralen Venenkatheters (CVC). und Aufenthalt auf der Intensivstation und chirurgische Eingriffe in den 30 Tagen vor Studieneinschluss. Unter Verwendung des Charlson-Scores wird ein zusammengesetzter Score von Komorbiditäten abgeleitet. Die Schwere der Erkrankung bei Vorstellung wird anhand der Kriterien von McCabe und Jackson quantifiziert. Antibiotika, die während eines Zeitraums von 30 Tagen vor der Aufnahme in die Studie und für mindestens 48 Stunden verabreicht wurden, werden aufgezeichnet. Für die Analyse der Risikofaktoren wird die orale und intravenöse Antibiotikaexposition nach einzelnen Antibiotika und Klassen analysiert und umfasst Penicilline, Vancomycin, Cephalosporine, Antibiotika mit überwiegend anaerober Aktivität (Metronidazol und Clindamycin), Aminoglykoside, Chinolone und Carbapeneme. Die Aufenthaltsdauer (LOS) nach der Infektionsdiagnose, das Infektionsmanagement, der Zeitpunkt und die Art der antimikrobiellen Therapie, die Ergebnisse der klinischen Nachsorgekulturen (falls vorhanden), hämatogene Komplikationen und der Tod werden ebenfalls aus den Krankenakten extrahiert. Mikrobiologische Aufzeichnungen werden auch auf die Wiederherstellung von Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE) oder Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) in den 12 Monaten vor der Aufnahme in die Studie überprüft. Alle Patienten mit Infektionen, die durch ESBL-produzierende Enterobacteriaceae verursacht werden, werden bis zur Entlassung aus dem Krankenhaus oder bis zum Tod weiterverfolgt.

Mortalität wird als Tod definiert, der während des Krankenhausaufenthalts der Studie eintritt. Eine angemessene antimikrobielle Therapie wird als Therapiebeginn mit Aktivität gegen die ESBL-produzierenden Enterobacteriaceae (entsprechend den Ergebnissen des antimikrobiellen Empfindlichkeitsmusters des Isolats) vom Tag vor bis 2 Tage nach dem ersten positiven klinischen Kulturergebnis definiert.

Ergebnisse Primäre Ergebnisse

1. Risikofaktoren für die Entstehung von Infektionen durch ESBL-produzierende Bakterien;
2. Risikofaktoren für eine unzureichende initiale antimikrobielle Therapie;
3. Gesamtmortalität und 30-Tage-Mortalität bei Patienten, die eine unzureichende initiale antimikrobielle Therapie erhalten (auswertbar nur bei Patienten mit Bakteriämie, abdominalen Infektionen und Pneumonie);
4. Variabilität der Gesamtmortalität und der 30-Tage-Mortalität je nach Infektionsort bei Patienten, die eine unzureichende initiale antimikrobielle Therapie erhielten (auswertbar nur bei Patienten mit Bakteriämie, abdominalen Infektionen und Pneumonie).

Sekundäre Ergebnisse

1. Dauer des Krankenhausaufenthalts;
2. Kosten einer unzureichenden Initialtherapie;
3. Tage der Entfieberung.

Statistische Analyse Am Ende der Studie werden zwei verschiedene Analysen durchgeführt: Die erste wird Patienten mit Bakteriämie, Bauchinfektionen und Lungenentzündung berücksichtigen und sich auf die Sterblichkeit konzentrieren; Die zweite Analyse wird alle infizierten Patienten berücksichtigen und sich auf die Risikofaktoranalyse und sekundäre Ergebnisse konzentrieren.

Begründung der Stichprobengröße Annahmen

Patienten mit Bakteriämie, Lungenentzündung, Bauchinfektionen, Hautinfektionen und Harnwegsinfektionen (erste Analyse):

Mortalität bei Patienten mit unzureichender Initialtherapie: 25 % Mortalität bei Patienten mit angemessener Initialtherapie: 13 %

Alle eingeschlossenen Patienten:

Prozentsatz Bakteriämie: 20 % Prozentsatz Lungenentzündung: 10 % Prozentsatz Bauchinfektionen: 15 % Prozentsatz Hautinfektionen: 3 % Prozentsatz Harnwegsinfektionen: 52 %

Primäre Endpunkte Risikofaktoren für Mortalität Unterschied der Mortalität zwischen Kontrollen (ungeeignete Therapie) und Fällen (angemessene Therapie): Wir erwarteten eine Reduktion von 25 % auf 13 %.

Sekundäre Endpunkte Unterschied in der Länge des Krankenhausaufenthalts zwischen Fällen (angemessene Therapie) und Kontrollen (unangemessene Therapie): Wir erwarteten einen Rückgang von 80 % (Dauer des Krankenhausaufenthalts < 15 Tage) auf 40 %.

Unterschied der Entfieberung zwischen Fällen (angemessene Therapie) und Kontrollen (unangemessene Therapie): Wir erwarteten einen Rückgang von 85 % (Entfieberung < 3 Tage) auf 30 %.

Angenommen, dass p1=p2, wobei p1 der Anteil in Grundgesamtheit 1 und p2 der Anteil in Grundgesamtheit 2 ist, und dass Alpha=0,05 (zweiseitig), Leistung = 0,80.

Erforderliche Stichprobengröße für die Analyse von Risikofaktoren für Mortalität: 366 Patienten mit Bakteriämie, Wundinfektionen, Lungenentzündung und Meningitis. Um 366 Patienten mit den oben gemeldeten Infektionen einzubeziehen, beträgt die Gesamtstichprobengröße wahrscheinlich 813 Patienten, die mit ESBL-produzierenden Enterobacteriaceae infiziert sind.

Mikrobiologische Analyse von Bakterienstämmen

Alle ESBL-produzierenden Isolate, die von an der Studie beteiligten Patienten in den Laboratorien für klinische Mikrobiologie jedes klinischen Zentrums stammen, werden gesammelt und weiteren Untersuchungen unterzogen, einschließlich:

• Bestätigung der Identifizierung auf Artenebene;
• Bestimmung des antimikrobiellen Resistenzprofils gegenüber einer Reihe von Standardarzneimitteln;
• Analyse der ESBL-Determinanten;
• Analyse der klonalen Verwandtschaft zwischen Bakterienisolaten derselben Spezies. Die Ergebnisse der mikrobiologischen Analyse werden zur Korrelation mit klinischen Daten verwendet, um die epidemiologische und klinische Auswirkung der ESBL-produzierenden Stämme zu bewerten.

Experimentelle Methodik

Die Bestätigung der Identifizierung der bakteriellen Isolate auf Speziesebene wird durch phänotypische Standardmethoden durchgeführt (10). Im Falle von Mehrdeutigkeit der Ergebnisse wird die Identifizierung durch 16S-rDNA-Sequenzierung bestätigt (16).

Antimikrobielle Empfindlichkeitstests werden durch Bouillon-Mikroverdünnung durchgeführt, wie vom CLSI empfohlen (3), und die kategoriale Zuordnung erfolgt anhand der CLSI-Grenzwerte (3). Die folgenden Wirkstoffe werden eingeschlossen: Ertapenem, Imipenem, Meropenem, Cefepim, Ceftazidim, Cefotaxim, Piperacillin/Tazobactam, Amoxicillin/Clavulanat, Ciprofloxacin, Levofloxacin, Gentamicin, Amikacin.

Die Natur der ESBL-Determinanten wird durch molekulare Analyse unter Verwendung von PCR und Sequenzierung untersucht, wie zuvor beschrieben (9, 15). Das Vorhandensein von ESBL-Determinanten vom TEM-, SHV-, CTX-M- und PER-Typ (d. e. die bekanntermaßen in Italien zirkulierenden (9, 15)) werden untersucht. Im Falle negativer Ergebnisse mit den verfügbaren Sonden wird der ESBL-Phänotyp erneut bestätigt und, falls positiv, die Natur von -Lactamase-Deerminanten untersucht durch: (i) analytische isoelektrische Fokussierung (IEF) auf Rohextrakte unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden (14); (ii) DNA-Mikroarray-Technologie unter Verwendung eines in unserem Labor entwickelten Mikroarrays für β-Lactamase-Gene, der Sonden für ungewöhnliche ESBL-Gene wie VEB-, GES-, BES-, SFO- und TLA-Enzyme enthält. Im Falle neuer ESBL-Gene, die durch die oben genannten Methoden nicht entdeckt werden (ein unwahrscheinliches Vorkommnis). Im Falle der Produktion von ESBL, die jedoch nicht durch das Vorhandensein bekannter Resistenzdeterminanten erklärt wird, werden die Resistenzdeterminanten mittels eines anschließenden Shotgun-Cloning-Ansatzes untersucht durch Mapping und Sequenzierung.

Die klonale Verwandtschaft zwischen Isolaten derselben Art wird durch Hochdurchsatz-Genotypisierungstechniken wie RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) und/oder durch AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)-Analyse und/oder REP-PCR (19-21) untersucht. In ausgewählten Isolaten werden die klonalen Beziehungen durch Makrorestriktionsanalyse der genomischen DNA durch Pulsed-Field-Gelelektrophorese (PFGE) durchgeführt.

Plasmidanalyse und Untersuchung von Resistenzdeterminanten gegenüber Nicht-β-Lactam-Mitteln (durch molekulare Techniken) werden in ausgewählten Fällen in Betracht gezogen, falls diese Informationen für die Korrelation mit klinischen und epidemiologischen Daten relevant sind.