Infecções causadas por Enterobacteriaceae produtoras de ESbL na Itália

PLANO DE PESQUISA E METODOLOGIA

População Todos os pacientes com infecções (i.e. bacteremia, pneumonia, infecções abdominais, infecções cutâneas e infecções do trato urinário) causadas por Enterobacteriaceae produtoras de ESBL.

Critérios de exclusão Crianças < 16 anos

Projeto de estudo Estudo de coorte prospectivo multicêntrico. Os pacientes correspondentes à definição do estudo serão detectados pela inspeção diária dos bancos de dados microbiológicos por um médico dedicado. Variáveis ​​epidemiológicas serão detectadas para todos os pacientes na admissão do estudo. Para identificar os fatores de risco para infecções (ou seja, bacteremia, pneumonia, infecções abdominais, infecções cutâneas e infecções do trato urinário) causadas por Enterobacteriaceae produtoras de ESBL, será realizado um estudo de caso-controle. Um paciente caso será definido como paciente adulto ( 16 anos de idade) que tenha uma infecção causada por enterobactérias produtoras de ESBL de acordo com as definições do Centro de Controle e Prevenção de Doenças de Atlanta (CDC). Nos Laboratórios de Microbiologia Clínica, a definição da produção de ESBL pelos Laboratórios de Microbiologia Clínica será de acordo com as diretrizes do CLSI (3), ou com as diretrizes da BSAC (http://www.bsac.org.uk) para espécies diferentes de Klebsiella spp ., E. coli e Proteus mirabilis. Um controle será selecionado para cada caso. O controle será escolhido entre todos os pacientes adultos internados no mesmo hospital durante o mesmo período (até 30 dias) e nos quais Enterobacteriaceae produtoras de ESBL não foram isoladas durante a internação. Caso haja mais de um controle disponível por caso, serão escolhidos os pacientes com data e horário de internação mais próximos do caso.

Para identificar os fatores de risco para mortalidade, um segundo estudo de caso-controle será realizado comparando pacientes infectados que morreram com pacientes infectados que sobreviveram (avaliável apenas em pacientes com bacteremia, infecções de feridas, pneumonia e meningite). Esta análise será realizada ajustando os resultados para terapia antimicrobiana empírica inadequada e local de infecção (ver definições a seguir).

Coleta de dados Registros médicos de internações e bancos de dados de microbiologia e farmácia serão revisados. Os dados coletados na inscrição no estudo incluirão: dados demográficos do paciente, transferência de outro hospital, residente em uma instituição de longa permanência ou lar de idosos, hospitalização anterior em um ano, estado ambulatorial, necessidade de hemodiálise crônica, presença de um cateter venoso central (CVC) e permanência na UTI e procedimentos cirúrgicos nos 30 dias anteriores à inclusão no estudo. Uma pontuação composta de doenças comórbidas será derivada usando a pontuação de Charlson. A gravidade da doença na apresentação será quantificada usando os critérios de McCabe e Jackson. Antibióticos administrados durante um período de 30 dias antes da inscrição no estudo e por pelo menos 48 horas serão registrados. Para a análise dos fatores de risco, a exposição a antibióticos orais e intravenosos será analisada por antibióticos individuais e por classes, e incluirá penicilinas, vancomicina, cefalosporinas, antibióticos com atividade predominantemente anaeróbica (metronidazol e clindamicina), aminoglicosídeos, quinolonas e carbapenêmicos. O tempo de permanência (LOS) após o diagnóstico de infecção, manejo de infecções, tempo e tipo de terapia antimicrobiana, resultados de culturas clínicas de acompanhamento (se houver), complicações hematogênicas e óbito também serão extraídos dos prontuários médicos. Os registros de microbiologia também serão revisados ​​para a recuperação de enterococos resistentes à vancomicina (VRE) ou S. aureus resistente à meticilina (MRSA) nos 12 meses anteriores à inscrição no estudo. Todos os pacientes com infecções causadas por Enterobacteriaceae produtoras de ESBL serão acompanhados até a alta hospitalar ou óbito.

A mortalidade será definida como a morte ocorrida durante a hospitalização do estudo. A terapia antimicrobiana adequada será definida como o início da terapia com atividade contra Enterobacteriaceae produtoras de ESBL (de acordo com os resultados do padrão de suscetibilidade antimicrobiana do isolado) desde o dia anterior até 2 dias após o resultado inicial da cultura clínica positiva.

Resultados Resultados primários

1. Fatores de risco para o desenvolvimento de infecções causadas por bactérias produtoras de ESBL;
2. Fatores de risco para terapia antimicrobiana inicial inadequada;
3. Mortalidade geral e mortalidade em 30 dias entre pacientes recebendo terapia antimicrobiana inicial inadequada (avaliável apenas em pacientes com bacteremia, infecções abdominais e pneumonia);
4. Variabilidade por local de infecção da mortalidade geral e mortalidade em 30 dias entre pacientes recebendo terapia antimicrobiana inicial inadequada (avaliável apenas em pacientes com bacteremia, infecções abdominais e pneumonia).

Resultados secundários

1. Tempo de internação;
2. Custos da terapia inicial inadequada;
3. Dias de defervescência.

Análise estatística Ao final do estudo serão realizadas duas análises diferentes: a primeira considerará pacientes com bacteremia, infecções abdominais e pneumonia, e será focada na mortalidade; a segunda análise considerará todos os pacientes infectados e será focada na análise de fatores de risco e desfechos secundários.

Pressupostos de justificação do tamanho da amostra

Pacientes com bacteremia, pneumonia, infecções abdominais, infecções cutâneas e infecções do trato urinário (primeira análise):

Mortalidade entre pacientes com terapia inicial inadequada: 25% Mortalidade entre pacientes com terapia inicial adequada: 13%

Todos os pacientes incluídos:

Porcentagem de bacteremia: 20% Porcentagem de pneumonia: 10% Porcentagem de infecções abdominais: 15% Porcentagem de infecções cutâneas: 3% Porcentagem de infecções do trato urinário: 52%

Desfechos primários Fatores de risco para mortalidade Diferença de mortalidade entre controles (terapia inadequada) e casos (terapia adequada): prevíamos uma redução de 25% para 13%.

Desfechos secundários Diferença no tempo de internação entre casos (terapia adequada) e controles (terapia inapropriada): prevíamos uma redução de 80% (tempo de internação < 15 dias) para 40%.

Diferença de defervescência entre casos (terapia adequada) e controles (terapia inadequada): prevíamos uma redução de 85% (defervescência < 3 dias) para 30%.

Assumindo que p1=p2, onde p1 é a proporção na população 1 e p2 é a proporção na população 2 e que alfa=0,05 (dois lados), potência = 0,80.

Tamanho amostral necessário para análise de fatores de risco para mortalidade: 366 pacientes com bacteremia, infecções de feridas, pneumonia e meningite. Para incluir 366 pacientes com as infecções relatadas acima, o tamanho total da amostra provavelmente será de 813 pacientes infectados com Enterobacteriaceae produtoras de ESBL.

Análise microbiológica de cepas bacterianas

Todos os isolados produtores de ESBL obtidos de pacientes incluídos no estudo nos Laboratórios de Microbiologia Clínica de cada Centro Clínico serão coletados e submetidos a uma investigação mais aprofundada, incluindo:

• confirmação da identificação ao nível da espécie;
• determinação do perfil de resistência antimicrobiana contra um conjunto padrão de drogas;
• análise dos determinantes da ESBL;
• análise da relação clonal entre isolados bacterianos da mesma espécie. Os resultados da análise microbiológica serão usados ​​para correlação com dados clínicos para avaliar o impacto epidemiológico e clínico das cepas produtoras de ESBL.

Metodologia experimental

A confirmação da identificação dos isolados bacterianos em nível de espécie será realizada por métodos fenotípicos padrão (10). Em caso de ambigüidade dos resultados, a identificação será confirmada por sequenciamento 16S rDNA (16).

O teste de suscetibilidade antimicrobiana será realizado por microdiluição em caldo conforme recomendado pelo CLSI (3), e a atribuição categórica será realizada usando os pontos de interrupção do CLSI (3). Os seguintes agentes serão incluídos: ertapenem, imipenem, meropenem, cefepima, ceftazidima, cefotaxima, piperacilina/tazobactam, amoxicilina/clavulanato, ciprofloxacina, levofloxacina, gentamicina, amicacina.

A natureza dos determinantes ESBL será investigada por análise molecular usando PCR e sequenciamento, conforme descrito anteriormente (9, 15). A presença de determinantes ESBL do tipo TEM-, SHV, CTX-M- e PER (i. e. aqueles conhecidos por circularem na Itália (9, 15)) serão investigados. Em caso de resultados negativos com as sondas disponíveis, o fenótipo ESBL será reconfirmado e, se positivo, a natureza dos deerminantes de -lactamase será estudada por meio de: (i) focalização isoelétrica analítica (IEF) em extratos brutos usando métodos previamente descritos métodos (14); (ii) tecnologia DNA microarray, utilizando um microarray para genes de β-lactamase desenvolvido em nosso laboratório, que inclui sondas para genes ESBL incomuns como as enzimas VEB, GES, BES, SFO e TLA. No caso de novos genes ESBL não detectados pelos métodos acima (uma ocorrência improvável). por mapeamento e sequenciamento.

O parentesco clonal entre isolados da mesma espécie será investigado por técnicas de genotipagem de alto rendimento como RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e/ou AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) análise e/ou REP PCR (19-21). Nos isolados selecionados, as relações clonais serão realizadas por análise de macrorrestrição do DNA genômico por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE).

A análise de plasmídeos e a investigação de determinantes de resistência a agentes não β-lactâmicos (por técnicas moleculares) serão consideradas em casos selecionados, caso essas informações sejam relevantes para correlação com dados clínicos e epidemiológicos.