Suplementacja szafranem w chorobie Stargardta (STARSAF02)

Tło planu badawczego Choroba Stargardta (STGD/FFM) jest najczęstszą dziedziczną recesywną dystrofią plamki żółtej (Blacharski, 1988) charakteryzującą się początkiem od młodzieńczego do młodego dorosłego, centralnym upośledzeniem wzroku, postępującą obustronną atrofią plamki żółtej i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), z częste pojawianie się pomarańczowo-żółtych plamek rozmieszczonych wokół plamki żółtej i/lub środkowych obrzeży siatkówki (Noble i Carr, 1971). Klinicznie podobne zaburzenie siatkówki, dno flavimaculatus (FFM), często wykazuje późniejszy wiek początku i wolniejszy postęp. Zasugerowano i wykazano (Allikmets i in., 1997), że STGD i FFM reprezentują zaburzenia alleliczne. Stwierdzono, że mutacje w genie kodującym transporter kasety wiążącej ATP (ABC) (ABCR), mapujący do chromosomu 1p13-p21, są odpowiedzialne za STGD (Allikmets i in., 1997). Gen ABCR ulega ekspresji wyłącznie i na wysokim poziomie w siatkówce, zarówno w fotoreceptorach pręcików, jak i czopków (Molday i in., 2000). Niedawne badanie przeprowadzone przez Wenga i in. (1999), badając mechanizmy molekularne leżące u podstaw degeneracji fotoreceptorów u myszy z nokautem ABCR, zaproponowali, że fotoreceptory umierają w wyniku „zatrucia” RPE przez nagromadzenie lipofuscyny i utratę roli wspierającej RPE. Akumulacja w komórkach RPE związku, A2E, powstająca w wyniku kondensacji fosfatydyletanoloaminy i all-trans-retinalu uwalnianego z fotoaktywowanej rodopsyny (Sparrow i in., 2000), prawdopodobnie prowadzi in vivo do zwiększonej absorpcji światła niebieskiego i fototoksyczności Uszkodzenie komórek RPE. Choroba wywołana mutacjami może wpływać na fotoreceptory zarówno pręcików, jak i czopków, we względnie wczesnych stadiach. Badania in vitro (Sun i Nathans, 2001) wykazały również, że sam ABCR jest skutecznym celem uszkodzeń fotooksydacyjnych, w których pośredniczą wszystkie trans-siatkówkowe.

Klinicznie, wiele doniesień dokumentuje nieprawidłowe funkcjonowanie zarówno czopków plamki, jak i obwodowych, a także pręcików w STGD/FFM (Moloney i in., 1983; Lachapelle i in., 1990). Istnieją również dowody (Lois i in., 2001), że STGD/FFM mogą być związane z różnymi wzorami dysfunkcji siatkówki, z selektywnym zaangażowaniem funkcji plamki żółtej lub bardziej rozpowszechnioną dysfunkcją obejmującą funkcję czopka i/lub pręcika, wykazującą spójność wewnątrzrodzinną. Opisano również charakterystyczne nieprawidłowości adaptacji do ciemności (Aleman i in., 1999), polegające na opóźnionym powrocie do podstawowej czułości ostatniej gałęzi krzywej adaptacji po wybieleniu. Podobne nieprawidłowości w adaptacji pręcików do ciemności stwierdzono ostatnio u myszy heterozygotycznych pod względem mutacji zerowej w genie ABCR (Mata i in., 2001). Dowody kliniczne (Parisi i in., 2002) wskazują, że również odzyskiwanie wrażliwości czopków po wybieleniu jest poważnie upośledzone w STG / FF, co sugeruje, że głęboko zmieniona recykling retinoidów, prowadząca do uszkodzeń fotooksydacyjnych, występuje szczególnie w fotoreceptorach czopków.

Ostatnie odkrycia eksperymentalne (Maccarone i wsp., 2008) wskazują, że szafran, pochodzący ze słupków Crocus Sativus, może odgrywać rolę jako środek neuroochronny siatkówki przed uszkodzeniami oksydacyjnymi. Rzeczywiście, szafran okazał się ochronny, zarówno pod względem morfologii, jak i funkcji, w szczurzym modelu degeneracji fotoreceptorów wywołanej światłem. W tym modelu uważa się, że śmierć komórki wynika ze stresu oksydacyjnego wywołanego długotrwałym wzrostem ciśnienia tlenu i fotoutlenianiem. Szafran jest atrakcyjnym kandydatem do badań, ponieważ znamiona Crocus sativus zawierają biologicznie wysokie stężenia interesujących związków chemicznych, w tym krocyny, krocetyny (Giaccio, 2004), których liczne wiązania C=C dają potencjał przeciwutleniający. Nie wspominając już o tym, że jego wielowiekowe stosowanie jako przyprawy, bez znanych złych skutków, zwiększa zaufanie do bezpiecznego zastosowania. Ponadto ostatnio doniesiono (Ochiai i in., 2007), że krocyny są zdolne do aktywacji szlaków metabolicznych w celu ochrony komórek przed apoptozą i zmniejszenia śmierci wywołanej światłem w izolowanych fotoreceptorach (Laabich i in., 2006), podczas gdy krocetyna (Giaccio , 2004) zwiększa dyfuzyjność tlenu przez ciecze, takie jak plazma. Biorąc pod uwagę wysokie tempo metabolizmu fotoreceptorów, dostępność tlenu może być kluczowym czynnikiem chroniącym je przed śmiercią. Ponadto Kanakis i in. (Kanakis i in., 2007) wykazali, że metabolity flawonoidów przeciwutleniających wiążą się bezpośrednio z DNA i indukują jego częściową konformację do beta-DNA, chroniąc w ten sposób komórkę przed uszkodzeniem. Na podstawie tych obserwacji staje się jasne, że ekstrakt z szafranu nie działa jako zwykły przeciwutleniacz. Szczególne właściwości składników szafranu wspierają hipotezę zaangażowania bardzo różnych sposobów działania, począwszy od aktywności antyoksydacyjnej, a skończywszy na bezpośredniej kontroli ekspresji genów. Składniki te mogą działać u ludzi jako środki ochronne przed uszkodzeniami oksydacyjnymi starzejącej się siatkówki i mogą naprawiać wczesne uszkodzenia fotoreceptorów związane z STG/FF, którego patofizjologię choroby powiązano w badaniach eksperymentalnych (Mata i in., 2001) z lekkim wywołane uszkodzeniem oksydacyjnym zewnętrznej siatkówki. W oczach STG/FF we wczesnych stadiach choroby prawidłowa liczba czopków fotoreceptorów jest częściowo zachowana, chociaż komórki mogą być dysfunkcyjne. W wyniku zbawiennego działania szafranu pula uszkodzonych, ale żywotnych fotoreceptorów może zwiększyć jego odpowiedź, co skutkuje poprawą wrażliwości siatkówki.

Celem niniejszego projektu jest ocena, czy suplementacja szafranem ma korzystny wpływ neuroprotekcyjny na uszkodzone siatkówki w wyniku mutacji ABCR-STD/FF.

Pacjenci z protokołu klinicznego Do tego badania zostanie włączona grupa 30 pacjentów z STG/FF (14 mężczyzn, 16 kobiet, w przedziale wiekowym: 15-68 lat). Pacjenci będą spełniać następujące kryteria włączenia: 1. Zwyrodnienie plamki żółtej i obwodowe siatkówki z typowymi zmianami dna oka (plamki siatkówki) i dysfunkcją siatkówki o wzorze stożkowo-pręcikowym, jak określono za pomocą standardowej elektroretinografii Ganzfelda i perymetrii dna oka dostosowanej do ciemności, oraz klasyczny wygląd dna oka 2. Względnie zachowana centralna funkcja siatkówki (pole widzenia wg Goldmanna V/4e > 30°, ostrość wzroku skorygowana EDTRS > 20/80) i stabilna centralna fiksacja stwierdzona za pomocą Visuskope, 3. Znany genotyp lub badany genotyp, 4. Co najmniej cztery kontrolne badania kliniczne w ciągu ostatnich trzech lat, 5. Brak lub minimalne zmętnienie mediów ocznych, 6. Brak współistniejącego oka (np. jaskra, niedowidzenie) lub choroby ogólnoustrojowe. Świadoma zgoda wszystkich pacjentów i grupy kontrolnej zostanie uzyskana po szczegółowym wyjaśnieniu celów i procedur badania.

Harmonogram leczenia i badań Pacjenci zostaną podzieleni na dwie grupy: 15 będzie leczonych doustną suplementacją dziennej dawki szafranu przez 90 dni, a 15 otrzyma placebo w tym samym okresie. Pod koniec 90-dniowego okresu pacjenci zostaną przeniesieni i przydzieleni odpowiednio do grupy otrzymującej placebo lub suplementację szafranem. U wszystkich pacjentów badanie kliniczne, w tym badanie ostrości wzroku za pomocą skalibrowanej standardowej tablicy Snellena oraz badanie dna oka za pomocą oftalmoskopii bezpośredniej i pośredniej, a także test FERG zostaną przeprowadzone na początku badania (linia wyjściowa) oraz po 180 dniach leczenia lub placebo. We wszystkich przypadkach zgodność będzie oceniana na podstawie wywiadu telefonicznego i liczenia tabletek. Działania niepożądane będą zgłaszane.

Metody elektrofizjologiczne Badanie FERG zostanie przeprowadzone zgodnie z wcześniej opublikowaną techniką (Falsini i in., 2000). W skrócie, ERG będą wywoływane przez generowaną przez diody LED sinusoidalną modulację luminancji okrągłego jednorodnego pola (średnica 18°, średnia luminancja 80 cd/m2, dominująca długość fali: 630 nm), prezentowaną z częstotliwością 41 Hz z tyłu miska Ganzfelda, oświetlona z taką samą średnią luminancją jak bodziec. Seria odpowiedzi FERG zostanie zebrana przy różnych głębokościach modulacji [określonych ilościowo za pomocą wzoru kontrastu luminancji Michelsona: 100%*(Lmax -Lmin)/(Lmax +Lmin), gdzie Lmax i Lmin to odpowiednio maksymalna i minimalna luminancja] między 16,5 % i 93,8% w krokach co 0,1 do 0,3 jednostki logarytmicznej. Sygnały FERG będą pozyskiwane sekwencyjnie dla sześciu wartości głębokości modulacji z zakresu od 16,5 do 93,5%, przedstawionych w porządku rosnącym. Dla każdego pacjenta amplitudy logarytmu FERG zostaną wykreślone jako funkcja głębokości modulacji logarytmicznej. Nachylenie otrzymanej funkcji zostanie określone za pomocą regresji liniowej. Z tej samej linii regresji próg FERG zostanie oszacowany na podstawie wartości logarytmicznej głębokości modulacji, uzyskując amplitudę kryterium odpowiadającą stosunkowi S/N równemu 3.

Psychofizyka Technika progu przyrostu zostanie wykorzystana do oceny powrotu czułości układu czopków po ekspozycji na wybielanie. Próg psychofizyczny zostanie określony w paracentralnych punktach pola widzenia z zachowaną wrażliwością wzrokową, poprzez prezentację błyskającego światła trwającego 0,5 sekundy na tle dostosowującym światło o 20 cd/m2. Po ocenie linii bazowej, intensywność progowa dla błyskającego światła zostanie zmierzona i wykreślona w funkcji czasu, po 30-sekundowej ekspozycji na światło adaptacyjne (dostarczane w projekcji Maxwella za pomocą skalibrowanego oftalmoskopu pośredniego), którego intensywność szacuje się na około 30 % fotopigmentu stożka. Wynikowa dynamiczna funkcja odzyskiwania, dopasowana przez funkcję wykładniczą, opisuje przywracanie czułości systemu fotopowego po wybieleniu i odzwierciedla albo szybkość inaktywacji wolnej opsyny, albo syntezę fotopigmentu. Opracowano sterowany komputerowo system, wykorzystujący dostępną w handlu aparaturę (Fadda i in., 2001) do pomiaru adaptacji systemu czopków do bielenia.

Analiza statystyczna Szacunkowa wielkość próby pacjentów do tego badania będzie oparta na wcześniejszych badaniach (Parisi i in., 2001), w których określono zmienność między- i wewnątrzobiektową (wyrażoną jako dane SD) parametrów FERG u pacjentów STG/FF. Zakładając między- i wewnątrz-obiektowe SD w amplitudzie i fazie FERG odpowiednio 0,1 logmicroV i 20 stopni, rozmiary próbek pacjentów przypisanych zarówno do Saffron, jak i placebo zapewniają moc 80%, przy alfa = 0,05, do wykrywania w każdym zgrupować różnicę test-retest (tj. 90 dni minus test linii bazowej) wynoszącą odpowiednio 0,1 logmicroV (SD: 0,1) i 30 stopni (SD: 20) odpowiednio w amplitudzie i fazie. Wyniki zostaną przeanalizowane za pomocą wielowymiarowych statystyk (wielowymiarowa analiza wariancji dla powtarzanych pomiarów, MANOVA). We wszystkich analizach p < 0,05 będzie uważane za statystycznie istotne.