Supplemento di zafferano nella malattia di Stargardt (STARSAF02)

Piano di ricerca Background La malattia di Stargardt (STGD/FFM) è la più comune distrofia maculare recessiva ereditaria (Blacharski, 1988) caratterizzata da insorgenza da giovane a giovane adulto, deficit visivo centrale, progressiva atrofia bilaterale della macula e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), con una frequente comparsa di macchie arancioni/gialle distribuite attorno alla macula e/o alla periferia media della retina (Noble e Carr, 1971). Un disturbo retinico clinicamente simile, il fondo flavimaculato (FFM), mostra spesso età di insorgenza più tardive e progressione più lenta. È stato suggerito e dimostrato (Allikmets et al., 1997) che STGD e FFM rappresentano disordini allelici. Le mutazioni nel gene che codifica per un trasportatore di cassette leganti ATP (ABC) (ABCR), mappato sul cromosoma 1p13-p21, sono state ritenute responsabili di STGD (Allikmets et al., 1997). Il gene ABCR è espresso esclusivamente e ad alti livelli nella retina, nei fotorecettori sia dei coni che dei bastoncelli (Molday et al., 2000). Un recente studio di Weng et al. (1999), studiando i meccanismi molecolari alla base della degenerazione dei fotorecettori nei topi ABCR knock-out, hanno proposto che i fotorecettori muoiano come conseguenza dell'"avvelenamento" dell'RPE dovuto all'accumulo di lipofuscina e alla perdita del ruolo di supporto dell'RPE. L'accumulo all'interno delle cellule RPE di un composto, A2E, che si forma dalla condensazione della fosfatidiletanlolamina e del tutto trans-retinico rilasciato dalla rodopsina fotoattivata (Sparrow et al., 2000), porta probabilmente in vivo ad un aumento dell'assorbimento di luci blu e a Danno cellulare RPE. La malattia indotta dalla mutazione può colpire sia i fotorecettori dei coni che dei bastoncelli, in stadi relativamente precoci. Studi in vitro (Sun e Nathans, 2001) hanno anche dimostrato che l'ABCR stesso è un bersaglio efficiente del danno fotoossidativo tutto transretinico-mediato.

Clinicamente, molti rapporti hanno documentato un funzionamento anormale dei coni maculari e periferici, così come dei bastoncelli, in STGD/FFM (Moloney et al., 1983; Lachapelle et al., 1990). Esistono anche evidenze (Lois et al., 2001) che STGD/FFM possono essere associate a diversi modelli di disfunzione retinica, con un coinvolgimento selettivo della funzione maculare, o disfunzione più diffusa che coinvolge la funzione dei coni e/o dei bastoncelli, mostrando una consistenza intrafamiliare. Sono state descritte anche anomalie caratteristiche dell'adattamento al buio (Aleman et al., 1999), che comportano un ritardato recupero post-candeggina, rispetto alla sensibilità basale, dell'ultimo ramo della curva di adattamento. Anomalie simili nell'adattamento al bastoncello scuro sono state recentemente riscontrate in un topo eterozigote per una mutazione nulla nel gene ABCR (Mata et al., 2001). L'evidenza clinica (Parisi et al., 2002) indica che anche il recupero della sensibilità del cono dopo lo sbiancamento è gravemente compromesso in STG/FF, suggerendo che il riciclo dei retinoidi profondamente alterato, che porta al danno fotoossidativo, si verifica specificamente nei fotorecettori del cono.

Recenti scoperte sperimentali (Maccarone et al., 2008) indicano che lo Zafferano, derivato dai pistilli di Crocus Sativus, può avere un ruolo come neuroprotettore retinico contro il danno ossidativo. In effetti, lo zafferano ha dimostrato di essere protettivo, sia per la morfologia che per la funzione, in un modello di ratto di degenerazione dei fotorecettori indotta dalla luce. In questo modello, si ritiene che la morte cellulare derivi dallo stress ossidativo indotto da un aumento prolungato della tensione di ossigeno e dalla fotoossidazione. Lo zafferano è un candidato interessante da testare perché le stimmate di Crocus sativus contengono concentrazioni biologicamente elevate di composti chimici interessanti tra cui crocina, crocetina (Giaccio, 2004), i cui molteplici legami C=C conferiscono il potenziale antiossidante. Per non parlare del fatto che il suo uso secolare come spezia, senza effetti negativi noti, aumenta la fiducia nella sicura applicabilità. Inoltre è stato recentemente riportato (Ochiai et al., 2007) che le crocine sono in grado di attivare vie metaboliche per proteggere le cellule dall'apoptosi e ridurre la morte indotta dalla luce nei fotorecettori isolati (Laabich et al., 2006), mentre la crocetina (Giaccio , 2004) aumenta la diffusività dell'ossigeno attraverso liquidi, come il plasma. Considerando l'alto tasso metabolico dei fotorecettori, la disponibilità di ossigeno può essere un fattore critico per proteggerli dalla morte. Inoltre, Kanakis et al. (Kanakis et al, 2007) hanno mostrato che i metaboliti dei flavonoidi antiossidanti si legano direttamente al DNA e inducono la sua parziale conformazione a beta-DNA, proteggendo così la cellula dai danni. Sulla base di queste osservazioni emerge chiaramente che l'estratto di Zafferano non agisce come un semplice antiossidante. Le caratteristiche peculiari dei componenti dello Zafferano supportano l'ipotesi di un coinvolgimento di modalità d'azione molto diverse che vanno dall'attività antiossidante al controllo diretto dell'espressione genica. Questi componenti possono agire nell'uomo come agenti protettivi contro il danno ossidativo per la retina che invecchia, e possono riparare i danni precoci dei fotorecettori associati a STG/FF, la cui fisiopatologia della malattia è stata collegata da studi sperimentali (Mata et al, 2001) alla luce- danno ossidativo indotto alla retina esterna. Negli occhi STG/FF, nelle prime fasi della malattia, il normale numero di fotorecettori a cono è parzialmente mantenuto, anche se le cellule potrebbero essere disfunzionali. Come risultato degli effetti di salvataggio dello zafferano, il pool di fotorecettori danneggiati ma vitali potrebbe aumentare la sua risposta, con conseguente miglioramento della sensibilità retinica.

L'obiettivo del presente progetto è valutare se l'integrazione con Zafferano abbia un benefico effetto neuro-protettivo per le retine danneggiate come conseguenza della mutazione ABCR-STD/FF.

Pazienti del protocollo clinico Un gruppo di 30 pazienti STG/FF (14 maschi, 16 femmine, fascia di età: 15-68 anni) sarà incluso in questo studio. I pazienti soddisferanno i seguenti criteri di inclusione: 1. Degenerazione retinica maculare e periferica con tipiche lesioni del fondo oculare (macchie retiniche) e un modello di cono-asta della disfunzione retinica, come determinato dall'elettroretinografia di Ganzfeld standard e dalla perimetria del fondo oculare adattata all'oscurità e aspetto classico del fondo oculare , 2. Funzione retinica centrale relativamente preservata (campo visivo secondo Goldmann V/4e > 30°, acuità visiva corretta EDTRS > 20/80) e fissazione centrale stabile come determinato da un Visuskope, 3. Genotipo noto o genotipo in fase di studio, 4. Almeno quattro esami clinici di follow-up negli ultimi tre anni, 5. Nessuna o minima opacità dei media oculari, 6. Nessun concomitante oculare (ad es. glaucoma, ambliopia) o malattie sistemiche. Il consenso informato per tutti i pazienti ei controlli sarà ottenuto dopo che gli obiettivi e le procedure dello studio saranno spiegati in dettaglio.

Programma di trattamento e test I pazienti saranno divisi in due gruppi: 15 saranno trattati con integrazione orale di una dose giornaliera di zafferano per 90 giorni e 15 saranno sottoposti a trattamento con placebo durante lo stesso periodo. Al termine di un periodo di 90 giorni i pazienti verranno incrociati e assegnati rispettivamente alla supplementazione con placebo o zafferano. In tutti i pazienti, l'esame clinico, compreso il test dell'acuità visiva con una tabella di Snellen standard calibrata e l'esame del fondo oculare mediante oftalmoscopia diretta e indiretta, e il test FERG saranno eseguiti all'ingresso nello studio (basale) e dopo 180 giorni di trattamento o placebo. In tutti i casi, la conformità sarà giudicata tramite colloquio telefonico e conteggio delle pillole. Gli effetti collaterali avversi saranno segnalati.

Metodi elettrofisiologici Il test FERG verrà eseguito secondo una tecnica precedentemente pubblicata (Falsini et al., 2000). In breve, gli ERG saranno elicitati dalla modulazione di luminanza sinusoidale generata da LED di un campo circolare uniforme (18° di diametro, 80 cd/m2 di luminanza media, lunghezza d'onda dominante: 630 nm), presentato alla frequenza di 41 Hz sul retro di una ciotola di ganzfeld, illuminata alla stessa luminanza media dello stimolo. Verrà raccolta una serie di risposte FERG a diverse profondità di modulazione [quantificate dalla formula del contrasto di luminanza di Michelson: 100%*(Lmax -Lmin)/(Lmax +Lmin), dove Lmax e Lmin sono rispettivamente la luminanza massima e minima] tra 16,5 % e 93,8% in passi da 0,1 a 0,3 unità logaritmiche. I segnali FERG saranno acquisiti in sequenza per sei valori di profondità di modulazione compresi tra 16.5 e 93.5%, presentati in ordine crescente. Per ogni paziente verranno tracciate le ampiezze logaritmiche del FERG in funzione della profondità di modulazione logaritmica. La pendenza della funzione risultante sarà determinata da una regressione lineare. Dalla stessa linea di regressione, la soglia FERG sarà stimata dal valore della profondità di modulazione logaritmica ottenendo un'ampiezza di criterio, corrispondente a un rapporto S/N di 3.

Psicofisica Verrà utilizzata una tecnica di soglia di incremento per valutare il recupero della sensibilità del sistema di coni dopo l'esposizione allo sbiancamento. La soglia psicofisica sarà determinata nelle posizioni del campo visivo paracentrale con sensibilità visiva preservata, presentando una luce lampeggiante di 0,5 secondi su uno sfondo di adattamento alla luce di 20 cd/mq. Dopo la valutazione della linea di base, l'intensità della soglia per la luce lampeggiante sarà misurata e tracciata in funzione del tempo, dopo 30 secondi di esposizione a una luce di adattamento (consegnata in vista maxwelliana mediante un oftalmoscopio indiretto calibrato) la cui intensità è stimata sbiancamento circa 30 % del fotopigmento del cono. La funzione di recupero dinamico risultante, adattata da una funzione esponenziale, descrive il recupero della sensibilità del sistema fotopico dopo lo sbiancamento e riflette il tasso di inattivazione dell'opsina libera o la sintesi del fotopigmento. È stato sviluppato un sistema computerizzato, che utilizza un apparato disponibile in commercio (Fadda et al., 2001) per misurare l'adattamento allo sbiancamento del sistema a cono.

Analisi statistica Le stime della dimensione del campione dei pazienti per questo studio si baseranno su indagini precedenti (Parisi et al., 2001) in cui la variabilità tra soggetti e all'interno dei soggetti (espressa come SD dei dati) dei parametri FERG è stata determinata nei pazienti STG/FF. Assumendo SD tra soggetti e all'interno dei soggetti in ampiezza FERG e fase di 0,1 logmicroV e 20 gradi, rispettivamente, le dimensioni del campione di pazienti assegnati sia allo zafferano che al placebo forniscono una potenza dell'80%, con un alfa = 0,05, per il rilevamento in ciascuno raggruppare una differenza test-retest (ovvero 90 giorni meno il test di base) di 0,1 logmicroV (SD: 0,1) e 30 gradi (SD: 20) rispettivamente in ampiezza e fase. I risultati saranno analizzati mediante statistica multivariata (analisi multivariata della varianza per misure ripetute, MANOVA). In tutte le analisi sarà considerato statisticamente significativo un p<0.05.