Charakterystyka próchnicy RT.

1. Wstęp

   Rak głowy i szyi jest szóstym najczęściej występującym nowotworem na świecie i stanowi 4-5% wszystkich nowotworów złośliwych. Rak głowy i szyi (obejmujący jamę ustną, jamę nosową, gruczoły ślinowe, zatokę przynosową, gardło i krtań) jest jednym z 10 najczęściej diagnozowanych nowotworów w Wielkiej Brytanii. Według Cancer Research UK w 2013 roku w kraju zdiagnozowano raka jamy ustnej u 7591 osób, co stanowi 14. najczęściej występujący nowotwór w Wielkiej Brytanii.

   Radioterapia (RT) to leczenie pierwszego wyboru dla większości pacjentów z rakiem głowy i szyi, które jest miejscowym leczeniem mającym na celu kontrolę guza. Ponad 50% chorych na nowotwory głowy i szyi otrzymuje RT dostarczaną we frakcjach 2 Grays (Gy) dziennie przez 5 dni w tygodniu aż do zakończenia dawki terapeutycznej (średnia dawka skumulowana 55-77 Gy). RT stymuluje zmiany komórkowe, które niszczą komórki nowotworowe, ale może radykalnie wpływać na zdrowe tkanki jamy ustnej, zmieniając homeostazę tego złożonego środowiska. RT jest przyczyną wielu niekorzystnych reakcji tkanek jamy ustnej, takich jak trwałe uszkodzenie dużych i mniejszych gruczołów ślinowych (niedożywienie, kserostomia), modyfikacja tkanki łącznej i naczyniowej oraz zmniejszenie zdolności gojenia, zwłaszcza błony śluzowej i tkanek zmineralizowanych (zapalenie błony śluzowej) próchnica, osteoradionekroza). Aby spróbować zmniejszyć niekorzystne skutki uboczne RT trójwymiarowej (3D) tomografii komputerowej (CT), opracowano planową radioterapię znaną jako radioterapia z modulacją intensywności (IMRT).

   Istnieją ostre (zapalenie błony śluzowej) i późne działania niepożądane/następstwa, które RT wywołuje w zdrowych tkankach jamy ustnej. Próchnica wywołana promieniowaniem jest najczęstszym późnym efektem, ale jej pochodzenie i charakter nie są jasne. Próchnica związana z RT ma szybki początek w wyniku kombinacji czynników, takich jak zmiana składu społeczności drobnoustrojów jamy ustnej na rzecz bakterii kwasochłonnych, zmniejszone wydzielanie śliny, zła higiena jamy ustnej i zmiany w diecie. Pacjenci często odczuwają niewielki ból lub nie odczuwają go wcale, nawet w najcięższych przypadkach. Cechy histologiczne wskazują, że początek i rozwój próchnicy jest podobny do próchnicy niezwiązanej z radioterapią, ale miejsca dotknięte chorobą są inne. Próchnica związana z RT jest częstsza na powierzchni szyjno-wargowej/ krawędzi siecznej kłów i siekaczy, podczas gdy próchnica niezwiązana z RT występuje częściej w obszarach międzyzębowych/zgryzowych zębów tylnych (trzonowców i przedtrzonowców).

   Również próchnica związana z RT ma szybki postęp obwodowy, co może prowadzić do złamania zęba. Charakteryzuje się zlokalizowaną zmianą na powierzchni siecznej lub okluzyjnej, która rozprzestrzenia się i postępuje w stosunku do nieregularnej i uogólnionej erozji brzegu siecznego zęba. Ponadto zmiany mechaniczne (zwiększenie modułu sprężystości i sztywności) w obrębie struktury zęba zwiększają zużycie obszarów siecznych i okluzyjnych i mogą doprowadzić do całkowitego złamania zęba.

   Zniszczenie zęba jest jednym z najpoważniejszych następstw RT i może doprowadzić do całkowitego bezzębia w ciągu 3-5 lat. Leczenie stomatologiczne pacjentów po radioterapii jest trudne. Aby zachować zdrowie jamy ustnej i poprawić jakość życia (QoL), konieczne jest skompletowanie wielodyscyplinarnego zespołu (stomatolodzy zachowawczy, periodontolodzy, endodonci, higienistki stomatologiczne, radioterapeuci, onkolodzy, chirurdzy szczękowi). Prawie 50% osób, które przeżyły raka, zgłosiło depresję, niepokój lub napięcie związane z objawami suchości w jamie ustnej. Stąd następstwa RT niekorzystnie wpływają na jakość życia chorych na nowotwory głowy i szyi.

   Ogólnie rzecz biorąc, konieczna jest ilościowa analiza składników matrycy chemicznej, białek i zmian mikrobiologicznych zachodzących w zębach/jamie ustnej pacjentów poddanych RT, w celu określenia etiologii i patofizjologii dwóch najczęstszych działań niepożądanych (próchnica/zapalenie błony śluzowej) ), aby skorelować z pomiarem zapobiegawczym i odpowiednią opieką medyczną dla tej populacji. Na koniec konieczne jest przeprowadzenie pełnej oceny jamy ustnej przy użyciu zwalidowanego wskaźnika w celu stworzenia zapisu wyjściowego przed leczeniem i zwalidowanego pomiaru do porównania po RT i z osobami zdrowymi.

2. Cel Celem tego projektu jest przeprowadzenie dobrze kontrolowanego i zintegrowanego badania podłużnego pacjentów z HNC, korelującego dane biologiczne dotyczące parametrów biochemicznych, parametrów klinicznych i stanu zdrowia jamy ustnej, w celu przezwyciężenia ograniczeń wcześniejszych badań, które dotyczyły różnych skutków ubocznych radioterapii Pacjenci z HNC (zmniejszona liczba, retrospektywna, obserwacyjna, krótkoterminowa obserwacja, brak szczegółowej oceny klinicznej, skupienie się na leczeniu działań niepożądanych).

   Pierwszym celem tego badania będzie ilościowa analiza stanu jamy ustnej/zębów pacjentów z HNC przed i po IMRT oraz analiza możliwych związków między wynikami klinicznymi.

   Następnie ocenia się funkcję gruczołów ślinowych pacjentów z HNC przed i po IMRT, analizując stężenie białka i szybkość wydzielania oraz badając możliwe powiązania między tymi białkami a wynikami klinicznymi.

   Kolejnym celem jest określenie możliwego związku między stężeniem wybranych białek i szybkością wydzielania a wynikami zapalenia błony śluzowej jamy ustnej po IMRT, a zatem ostatecznym celem jest ocena, czy stężenie białka lub szybkość wydzielania śliny jest wiarygodnym predyktorem obecności i ciężkości zapalenia błony śluzowej.

   Hipoteza zerowa Nie będzie korelacji między składem biochemicznym śliny a doustnymi skutkami ubocznymi radioterapii u pacjentów z HNC przed i po radioterapii

3. Materiały i metody. Wniosek dotyczący etyki do Health Research Authority (ID projektu IRAS: 199100). Wszystkie próbki do badania zostałyby uzyskane z Oddziału Stomatologicznego Specjalnej Opieki KCL Dental Institute, Guy's Hospital oraz z Kliniki Stomatologicznej KCL Dental Institute.

Próbki będą zawierać ślinę, biofilm, wymazy z błony śluzowej, zębinę z próchnicą i/lub zęby. Pobieranie próbek wydłuży konwencjonalny czas leczenia o około 10 do 20 minut. Wszystkie próbki zostaną pobrane w 3 punktach czasowych przed i po IMRT od raka głowy i szyi do 12 miesięcy obserwacji.

Pacjenci w wieku powyżej 18 lat w celu analizy uzębienia stałego i przedziału wiekowego dla pacjentów onkologicznych mają ukończone 18 lat, obojga płci, na każdym etapie choroby, z wyjątkiem przerzutów odległych.

Pacjenci bez raka głowy i szyi dopasowani pod względem wieku i płci. Zgodnie z tymi kryteriami włączenia wykluczani są kolejni pacjenci w wieku poniżej 18 lat (uzębienie niestałe), niezdolni do wyrażenia zgody pacjenci, którym w ciągu ostatnich 3 miesięcy podawano antybiotyki ze względu na możliwość zmiany mikroflory jamy ustnej, pacjenci z chorobami ogólnoustrojowymi (np. zespół Sjögrena), osoby z niekontrolowanymi chorobami ogólnoustrojowymi, które mogą wpływać na wydzielanie śliny i mechanizm obronny żywiciela.

Wielkość próby Oświadczenie o obliczeniach Przed rozpoczęciem tego badania uzyskano porady statystyczne w celu określenia wielkości próby wymaganej do odpowiedniego obliczenia mocy. Obliczenia mocy oparto na porównaniu średnich poziomów białka u pacjentów z rakiem głowy i szyi przed i po IMRT. Badanie z 80% mocą na 5% poziomie istotności (Chaudhury i in., 2015) będzie w stanie wykryć prawdziwą różnicę we wszystkich parametrach przed i po leczeniu raka z wielkością efektu 0,5 (wysoka według Cohena 1988) za pomocą dwustronny test wymagałby całkowitej próby 35 pacjentów

Proponowana analiza statystyczna:

Statystyki opisowe zostaną wykorzystane do podsumowania charakterystyki próbki i innych czynników klinicznych.

Wszystkie analizy zostaną przeprowadzone przy użyciu STATA 15.1 (College Station, Texas USA, www.stata.com), Oprogramowanie GraphPad Prism 8 (La Jolla California, USA, www.graphpad.com) i Microsoft Excel 2018, po sprawdzeniu normalności. Normalność danych zostanie przetestowana dla wszystkich analiz parametrycznych za pomocą histogramu i wykresów pudełkowych. Wyniki wyrażono jako średnią ± SEM w stosunku do zmiennych, a „n” oznacza liczbę osobników, wartość p <0,05 uznano za istotną statystycznie.

Kolekcja próbek

Pobrane zostaną następujące próbki:

• niestymulowana ślina z całej jamy ustnej (UWMS), płukanie roztworem soli fizjologicznej
• biofilm płytki nazębnej
• wymazy z błony śluzowej zbierające zalegającą ślinę z wewnętrznego policzka
• wydobytej tkanki próchnicowej zębiny i/lub usuniętych zębów próchnicowych. Pobranie próbki wydłuży konwencjonalny czas leczenia o 15 minut. Próbki będą pobierane w ciągu dnia, rutynowo w godzinach od 13:30 do 15:30 w klinice dentystycznej, aby uniknąć wahań dziennych.

Pobieranie próbki niestymulowanej śliny z całej jamy ustnej (UWMS)

Próbki UWMS będą pobierane przez bierne ślinienie się do wstępnie zważonej 50 ml sterylnej stożkowej probówki polipropylenowej (Falcon; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) przez 10 minut. Wszyscy uczestnicy będą unikać jedzenia i picia przez co najmniej 60 minut przed pobraniem próbki. Próbki będą trzymane na lodzie w temperaturze 4°C. Po pobraniu probówki zostaną ponownie zważone i obliczona objętość śliny netto. Próbki śliny zostaną oznakowane i przechowywane w zamrażarkach o temperaturze -80°C do dalszej analizy. Szybkość przepływu śliny zostanie obliczona.

Kliniczna ocena jamy ustnej Raport dotyczący suchości w jamie ustnej i smaku zawierający odpowiedź na pytanie z zatwierdzonego kwestionariusza autorstwa Foxa i wsp. (Fox i wsp., 1987) oraz na pytanie pochodzące z systemu punktacji Late Effects of Normal Tissue/Somatic Objective Management Analitic (LENT/SOMA) .

Klasyfikacja zapalenia błony śluzowej jamy ustnej na podstawie skali toksyczności jamy ustnej Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) Stomatologiczna ocena zmian próchnicowych obecnych od widocznej klinicznie zmiany koloru do ciemnobrązowej na dowolnej powierzchni do otwartych zmian w jamie ustnej. Liczba zębów / zębów zepsutych, brakujących lub wypełnionych (DMFT) zostanie uwzględniona w ocenie klinicznej.

Analiza próbki

Próbki śliny UWMS Próbki zostaną przeanalizowane pod kątem całkowitej zawartości białka za pomocą testu kwasu bicynchoniowego (BCA), docelowego stężenia białka za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), barwienia kwasem nadjodowym Schiffa (PAS), błękitu brylantowego Coomassie i aktywności α-amylazy za pomocą standardowy test enzymu kinetycznego (Salimetrics).

Przed analizą biochemiczną próbki UWMS będą wirowane przy 10000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4°C. Supernatant zostanie oddzielony w celu wykorzystania do analizy zawartości białka, a osad zostanie zakonserwowany w celu przeprowadzenia ekstrakcji DNA.

Analiza białek (stężenie i szybkość wydzielania) Wybrano mucynę 5B, mucynę 7, IgA, α-amylazę, anhydrazę węglanową VI albuminy, białko bogate w kwaśną prolinę i staterynę ze względu na ich związek z obroną gospodarza, działaniem przeciwbakteryjnym, przyleganiem bakterii, kolonizacją, błonką śluzową, błonka szkliwa, lepkosprężystość, właściwości reologiczne, smarowanie i remineralizacja.

Całkowita szybkość wydzielania białka zostanie obliczona przez pomnożenie szybkości przepływu śliny i stężenia białka w ug/min (Carpenter i in., 2000).

Mucyna 5B i 7 zostanie oznaczona ilościowo za pomocą PAS, ?-amylaza w teście kinetycznym, stężenie IgA, albuminy, cystatyny S, białka bogatego w prolinę i stateryny w UWMS zostanie określone za pomocą testu ELISA.