La caratterizzazione della carie RT.

1. introduzione

   Il tumore della testa e del collo è il sesto tumore più comune al mondo e rappresenta il 4-5% di tutte le neoplasie maligne. Il cancro della testa e del collo (include il cavo orale, la cavità nasale, le ghiandole salivari, i seni paranasali, la faringe e la laringe) è uno dei primi 10 tumori più diagnosticati nel Regno Unito. Secondo Cancer Research UK, nel 2013 nel paese sono stati diagnosticati 7591 nuovi tumori orali, che rappresentano il 14° tumore più comune nel Regno Unito.

   La radioterapia (RT) è il trattamento di prima scelta per la maggior parte dei pazienti con cancro della testa e del collo, che è un trattamento localizzato per controllare il tumore. Più del 50% dei pazienti affetti da tumore della testa e del collo riceve la RT somministrata in frazioni di 2 Gray (Gy) al giorno per 5 giorni alla settimana fino alla fine del dosaggio della terapia (dose cumulativa media 55-77 Gy). La RT stimola i cambiamenti cellulari che distruggono le cellule tumorali, ma può influenzare drasticamente i tessuti orali sani alterando l'omeostasi di questo ambiente complesso. La RT è la causa di un'ampia gamma di reazioni avverse del tessuto orale come danni permanenti delle ghiandole salivari maggiori e minori (iposalivazione, xerostomia), modificazione dei tessuti connettivi e vascolari e riduzione della capacità di guarigione soprattutto nelle mucose e nei tessuti mineralizzati (mucosite , lesioni cariose, osteoradionecrosi). Per cercare di ridurre gli effetti collaterali negativi della RT è stata sviluppata la radioterapia pianificata con tomografia computerizzata (TC) tridimensionale (3D) nota come radioterapia a modulazione di intensità (IMRT).

   Esistono effetti avversi/sequele acuti (mucosite) ea insorgenza tardiva che la RT induce nei tessuti orali sani. La carie dentale indotta da radiazioni è l'effetto tardivo più comune, ma la sua origine e la sua natura non sono chiare. Le carie correlate alla RT hanno una rapida insorgenza come risultato di una combinazione di fattori come il cambiamento nella composizione della comunità microbica orale che favorisce i batteri acidofili, ipo-salivazione, scarsa igiene orale e alterazioni della dieta. I pazienti spesso hanno poco/nessun dolore, anche nei casi più gravi. Le caratteristiche istologiche mostrano che l'insorgenza e lo sviluppo della carie è simile a quella non correlata alla RT ma i siti interessati sono diversi. Infatti le carie da RT sono più frequenti sulla superficie cervico-labiale/bordo incisale dei canini e degli incisivi mentre quelle non da RT sono più frequenti nelle aree interprossimali/occlusali dei denti posteriori (molari e premolari).

   Inoltre, la carie associata a RT ha una rapida progressione circonferenziale che può portare alla frattura del dente. È caratterizzata da una lesione localizzata alle superfici incisali od occlusali che si diffonde e progredisce in relazione all'erosione irregolare e generalizzata del bordo incisale del dente. Inoltre, i cambiamenti meccanici (aumento del modulo elastico e della rigidità) all'interno della struttura del dente aumentano l'usura delle aree incisali e occlusali e potrebbero portare alla frattura completa del dente.

   La distruzione dei denti è una delle conseguenze più gravi della RT e può produrre un'edentulia completa in 3 - 5 anni. La gestione dentale dei pazienti con RT è impegnativa. È necessario riunire un team multidisciplinare (odontoiatri restauratori, parodontologi, endodontisti, igienisti dentali, radioterapisti, oncologi medici e chirurghi orali) per mantenere la salute orale e migliorare la qualità della vita (QoL). Quasi il 50% dei sopravvissuti al cancro ha riportato depressione, preoccupazione o tensione correlata ai sintomi di secchezza orale. Quindi, le sequele di RT influenzano negativamente la qualità della vita dei pazienti con cancro della testa e del collo.

   Nel complesso, è necessaria l'analisi quantitativa dei componenti della matrice chimica, delle proteine ​​e delle alterazioni microbiche che si verificano nei denti/cavità orale dei pazienti, sottoposti a RT, al fine di determinare l'eziologia e la fisiopatologia dei due effetti collaterali prevalenti (carie/mucosite ) da correlare con misurazioni preventive e cure terapeutiche appropriate per questa popolazione. Infine, è necessario eseguire una valutazione orale completa utilizzando un indice convalidato al fine di creare un record di riferimento prima del trattamento e una misura convalidata da confrontare dopo la RT e con individui sani.

2. Obiettivo Lo scopo di questo progetto è quello di eseguire uno studio longitudinale ben controllato e integrato di pazienti affetti da HNC correlando dati biochimici di parametri biochimici, parametri clinici e stato di salute orale, per superare i limiti di studi precedenti, che hanno esaminato i diversi effetti collaterali della radioterapia di Pazienti HNC (numero ridotto, retrospettivo, osservazionale, follow-up a breve termine, mancanza di valutazione clinica dettagliata, focalizzato sul trattamento degli effetti collaterali).

   Il primo obiettivo di questo studio sarà quello di eseguire un'analisi quantitativa dello stato orale/dentale dei pazienti HNC pre e post IMRT e analizzare le possibili associazioni tra i risultati clinici.

   Seguito dalla valutazione della funzione delle ghiandole salivari dei pazienti con HNC prima e dopo l'IMRT analizzando la concentrazione proteica e il tasso di secrezione e studiando le possibili associazioni tra queste proteine ​​e gli esiti clinici.

   Il prossimo obiettivo è determinare la possibile associazione tra la concentrazione proteica selezionata e il tasso di secrezione e gli esiti della mucosite orale dopo IMRT, e quindi, l'obiettivo finale è valutare se la concentrazione proteica o il tasso di secrezione della saliva sia un predittore affidabile della presenza e della gravità della mucosite.

   Ipotesi nulla Non ci sarà alcuna correlazione tra la composizione biochimica della saliva e gli effetti collaterali orali della radioterapia nei pazienti HNC prima e dopo la radioterapia

3. Materiali e metodi. Applicazione di etica all'autorità per la ricerca sanitaria (ID progetto IRAS: 199100). Tutti i campioni dello studio sarebbero stati ottenuti dall'unità dentale Special Care del KCL Dental Institute, dal Guy's Hospital e dalla clinica odontoiatrica del KCL Dental Institute.

I campioni includeranno saliva, biofilm, tamponi di mucosa, dentina e/o denti cariati. La raccolta dei campioni aggiungerà circa 10-20 minuti al tempo di trattamento convenzionale. Tutti i campioni saranno raccolti in 3 punti temporali prima e dopo l'IMRT dal tumore della testa e del collo fino a 12 mesi di follow-up.

Pazienti di età superiore ai 18 anni al fine di analizzare la dentizione permanente e la fascia di età per i malati di cancro sono maggiori di 18 anni, entrambi i sessi, in qualsiasi stadio della malattia, tranne dove metastasi a distanza.

Soggetti senza età e sesso del cancro della testa e del collo abbinati. Seguendo questi criteri di inclusione vengono esclusi i successivi pazienti di età inferiore ai 18 anni (dentatura non permanente), impossibilitati a dare il consenso pazienti a cui sono stati somministrati antibiotici nei 3 mesi precedenti perché il microbiota orale potrebbe essere alterato, pazienti con malattia sistemica (come sindrome di Sjogren), soggetti con malattie sistemiche non controllate, che possono influenzare il flusso salivare e il meccanismo di difesa dell'ospite.

Dichiarazione di calcolo della dimensione del campione Prima di iniziare questo studio è stata ottenuta una consulenza statistica al fine di determinare la dimensione del campione richiesta da un calcolo di potenza adeguato. Il calcolo della potenza si basava sul confronto dei livelli proteici medi nei pazienti con tumore della testa e del collo prima e dopo l'IMRT. Uno studio con una potenza dell'80% a un livello di significatività del 5% (Chaudhury et al., 2015) sarà in grado di rilevare la vera differenza in tutti i parametri prima e dopo il trattamento del cancro con una dimensione dell'effetto di 0,5 (alta secondo Cohen 1988) utilizzando il test a due code richiederebbe un campione totale di 35 pazienti

Analisi statistica proposta:

Verranno utilizzate statistiche descrittive per riassumere le caratteristiche del campione e altri fattori clinici.

Tutte le analisi saranno effettuate utilizzando STATA 15.1 (College Station, Texas USA, www.stata.com), Software GraphPad Prism 8 (La Jolla California USA, www.graphpad.com) e Microsoft Excel 2018, dopo aver verificato la normalità. La normalità dei dati sarà testata per tutte le analisi parametriche mediante istogramma e box plot. I risultati sono espressi come media ± SEM relativa alle variabili e 'n' rappresenta il numero di soggetti, il valore p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Raccolta di campioni

Verranno raccolti i seguenti campioni:

• saliva della bocca intera non stimolata (UWMS), risciacquo con soluzione salina
• biofilm di placca
• tamponi mucosi che raccolgono la saliva residua dall'interno della guancia
• tessuto dentinale cariato scavato e/o denti cariati estratti. La raccolta del campione aggiungerà 15 minuti al tempo di trattamento convenzionale. I campioni saranno raccolti durante il giorno, di routine tra le ore 13:30 e le ore 15:30 nello studio dentistico nel tentativo di evitare variazioni diurne.

Raccolta di campioni di saliva dalla bocca intera non stimolata (UWMS)

I campioni UWMS saranno ottenuti mediante sbavatura passiva in un tubo di polipropilene conico sterile pre-pesato da 50 mL (Falcon; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) per 10 minuti. Tutti i partecipanti eviteranno cibi e bevande per almeno 60 minuti prima della raccolta del campione. I campioni verranno mantenuti in ghiaccio a 4°C. Dopo la raccolta, le provette verranno ripesate e verrà calcolato il volume netto di saliva. I campioni di saliva saranno etichettati e conservati in congelatori a -80 °C per ulteriori analisi. Verrà calcolata la velocità del flusso di saliva.

Rapporto sulla secchezza della bocca e sul gusto della valutazione orale clinica che risponde a una domanda di un questionario convalidato da Fox et al (Fox et al., 1987) e a una domanda estratta dal sistema di punteggio LENT/SOMA (Late Effects of Normal Tissue/Somatic Objective Management Analytic) .

Classificazione della mucosite orale utilizzando la scala di tossicità orale dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS) Valutazione dentale delle lesioni cariose presenti dal cambiamento di colore clinicamente visibile al marrone scuro su qualsiasi superficie per aprire lesioni nella cavità orale. Il numero di denti / cariati, mancanti o otturati (DMFT) sarà incluso nella valutazione clinica.

Analisi del campione

Campioni di saliva UWMS I campioni saranno analizzati per il contenuto proteico totale utilizzando il test dell'acido bicinconinico (BCA), la concentrazione proteica mirata mediante test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), la colorazione con acido periodico di Schiff (PAS), il blu brillante di Coomassie e l'attività dell'α-amilasi mediante il dosaggio standard degli enzimi cinetici (Salimetrics).

Prima dell'analisi biochimica i campioni UWMS saranno centrifugati a 10000 RPM per 5 minuti a 4°C. Il supernatante sarà separato per essere utilizzato per analizzare il contenuto proteico e il pellet è stato conservato per eseguire l'estrazione del DNA.

Analisi delle proteine ​​(concentrazione e velocità di secrezione) Mucina 5B mucina 7, IgA, α-amilasi, albumina anidrasi carbonica VI, proteina ricca di prolina acida e staterina sono state selezionate per la loro relazione con la difesa dell'ospite, l'antimicrobica, l'aderenza batterica, la colonizzazione, la pellicola della mucosa, pellicola di smalto, proprietà viscoelastiche, reologiche, lubrificazione e remineralizzazione.

Il tasso di secrezione proteica totale sarà calcolato moltiplicando il flusso salivare e la concentrazione proteica in ug/min (Carpenter et al., 2000).

Le mucine 5B e 7 saranno quantificate mediante PAS, l'α-amilasi mediante un saggio cinetico, le IgA, l'albumina, la cistatina S, la proteina ricca di prolina e la concentrazione di staterina in UWMS saranno determinate mediante ELISA.