Okrągłe RNA SMN jako potencjalne biomarkery odpowiedzi terapeutycznej na Nusinersen u pacjentów z rdzeniowym zanikiem mięśni

Tło/stan wiedzy SMA stanowi najczęstszą genetyczną przyczynę śmierci niemowląt z częstością około 1 na 10 000 żywych urodzeń. Jest to autosomalne recesywne zaburzenie neurodegeneracyjne spowodowane przez homozygotyczną delecję lub mutację punktową w genie SMN1, który koduje białko SMN. Zmniejszony poziom SMN powoduje utratę neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym i prowadzi do postępującego osłabienia i zaniku mięśni u pacjentów z SMA. Warto zauważyć, że ludzie zachowują prawie identyczny gen SMN2, ponieważ całkowity brak jakiejkolwiek formy SMN jest embrionalnie śmiertelny. Niemniej jednak, chociaż SMN2 koduje praktycznie identyczne białko, jego poziomy ekspresji nie są wystarczające do pełnego przywrócenia aktywności SMN, ponieważ translacyjne ciche przejście C-to-T w pozycji +6 w eksonie 7 determinuje pominięcie tego eksonu z dojrzałego mRNA. Powstałe białko SMN7 wykazuje krótszy region C-końcowy i jest wysoce niestabilne. Obecnie Nusinersen jest jedynym lekiem zatwierdzonym przez FDA do leczenia SMA. Jest to antysensowny oligonukleotyd (ASO), który koryguje splicing eksonu 7 SMN2 poprzez maskowanie wyciszacza splicingu (ISS-N1) w intronie 7. Chociaż dooponowe podawanie Nusinersen łagodzi fenotypy SMA u pacjentów, prowadząc do znacznej poprawy funkcji motorycznych, nie wszyscy pacjenci z SMA reagują równie dobrze na to leczenie. Zatem identyfikacja i opracowanie terapii skojarzonych i spersonalizowanych, które uwzględniają zmienność kliniczną obserwowaną między pacjentami tego samego genotypu, jest niezbędne do poprawy leczenia klinicznego SMA. Ze względu na swoje właściwości biochemiczne (stabilność, akumulacja podczas starzenia, obfite wydzielanie w płynach ustrojowych) koliste RNA stają się obecnie doskonałymi i obiecującymi biomarkerami do diagnostyki i prognozowania wielu patologii, takich jak nowotwory. W komórkach eukariotycznych odkryto tysiące circRNA, a ich ekspresja jest często regulowana w sposób specyficzny dla typu komórki i etapu. Chociaż większość circRNA nadal nie ma adnotacji funkcjonalnych, ostatnie obserwacje ujawniły, że odgrywają one potencjalnie ważną rolę w regulacji genów. Okrągłe RNA (circRNA) pochodzą z procesu składania wstecznego pre-mRNA (tj. kowalencyjnego łączenia miejsca dawcy splicingu w dół z miejscem akceptora splicingu w górę z tego samego genu). Ponieważ splicing kanoniczny i splicing wsteczny wykorzystują ten sam pre-mRNA i oba są obsługiwane przez spliceosom, prawdopodobnie konkurują ze sobą. Głównym mechanizmem sprzyjającym cyrkulacji pre-mRNA jest obecność powtarzalnych sekwencji w odwróconej orientacji, aw szczególności odwróconych powtórzeń Alu.

Powtórzenia Alu należą do rodziny retrotranspozonów specyficznych dla naczelnych (SINE). Mają ~ 300 nukleotydów długości i stanowią do 11% opisanego ludzkiego genomu. Ich obecność w genach kodujących może modulować ekspresję genów na wielu warstwach, w tym transkrypcję, splicing, eksport i translację, wpływając w ten sposób głęboko na regulację genów „gospodarza”. SMN należy do najlepszych ludzkich genów pod względem gęstości Alu, z których wiele występuje w odwróconej orientacji. Co uderzające, Alus napędza rozległą i alternatywną cyrkulację pre-mRNA SMN, wpływając w ten sposób negatywnie na potencjał locus do kodowania białek. Tak więc, w oparciu o wstępne wyniki, proponuje się zbadanie, czy bezkomórkowe circRNA SMN krążące w płynach ustrojowych pacjentów z SMA stanowią biomarkery wykazujące moc diagnostyczną i prognostyczną do przewidywania odpowiedzi klinicznej na terapię Nusinersenem.

Hipoteza i znaczenie:

Badania proponowane w ramach tego projektu mają na celu zbadanie, czy circRNA SMN stanowią wartościowe biomarkery do przewidywania skuteczności Nusinersen u pacjentów z SMA, którzy wykazują różne stopnie ciężkości choroby. W szczególności nasza praca może pomóc w lepszym rozwarstwieniu licznych pacjentów z SMA, którzy nie reagują zgodnie z oczekiwaniami na leczenie i/lub u których liczba kopii genu SMN2 nie koreluje z ciężkością fenotypu. Ponieważ ekstensywna produkcja okrągłych transkryptów SMN, zamiast transkryptów liniowych, u niektórych pacjentów może zmniejszyć skuteczność Nusinersen, który selektywnie działa na transkrypt liniowy, nasze badanie może również podkreślić potrzebę terapii skojarzonej, aby również ograniczyć krążenie pre-mRNA w tacy pacjenci. W niedalekiej przyszłości rozwój „spersonalizowanych” terapii mógłby obejść takie „indywidualne” różnice w regulacji ekspresji SMN, poprawiając w ten sposób kliniczną odpowiedź pacjentów na SMA na Nusinersen.

Wstępne dane:

Porównanie całego genomu gęstości Alu uwydatniło SMN wśród najwyższych ludzkich genów. Kontrola pozycji i orientacji Alu w SMN ujawniła obecność kilku elementów Alu z odwróconymi powtórzeniami między intronami (IRAlus), które mogą pośredniczyć w biogenezie circRNA. Nasza analiza bioinformatyczna (dane nie pokazane) ujawniła liczne IRAlus w intronie 1 i 6, najdłuższe introny w SMN, potencjalnie faworyzując w ten sposób składanie wsteczne eksonu 6 z eksonem 2a. Rzeczywiście, RT-PCR z użyciem rozbieżnych starterów w eksonie 2b i eksonie 6, a następnie sekwencjonowanie zidentyfikowało circRNA zarówno w ludzkich fibroblastach SMA (GM03813), jak i komórkach HEK293T. Ponieważ zdarzenia splicingu wstecznego zachodzą kosztem splicingu kanonicznego, postawiono hipotezę o konkurencji między biogenezą transkryptów kołowych i liniowych, która może wpływać na ekspresję białka SMN. Zgodnie z hipotezą, utrata DHX9, helikazy, która hamuje biogenezę circRNA, znacznie zwiększyła ekspresję circRNA SMN i zmniejszyła ekspresję białka SMN. Ponadto administracja ASO E8, pod którą kryje się tajemniczy 5&39; SS w eksonie 8, który jest używany do biogenezy dwóch circRNA, ale nie do liniowego składania SMN, selektywnie zmniejszał docelowe circRNA SMN i uratował ekspresję białka SMN do ~ 30% skuteczności ASO ISSN1. Wyniki te wskazują, że circRNA SMN konkuruje z potencjałem locus do kodowania białek.

Cele szczegółowe 1:

Identyfikacja bezkomórkowych circRNA SMN w płynach ustrojowych pacjentów z SMA jako potencjalnych biomarkerów przed i po leczeniu Nusinersenem

Cele szczegółowe 2:

Ocena mocy prognostycznej krążących circRNA SMN jako predyktorów odpowiedzi klinicznej pacjentów z SMA na Nusinersen

Cele szczegółowe 3:

Identyfikacja ludzkich polimorfizmów intronowych obecnych w odwróconych elementach Alu i ich wpływ na skuteczność leczenia Nusinersenem

Projekt eksperymentalny Cel 1:

Chorzy na SMA będą przyjmowani na podstawie dokumentacji genetycznej homozygotycznej delecji lub mutacji w genie SMN1 i grupowani na SMA typu I (1,1, 1,5 i 1,9), SMA typu II (od 2,3 do 2,9) oraz SMA typu -III (3A i 3B) na podstawie liczby kopii genu SMN2 i początku objawów klinicznych. Planuje się włączenie dziesięciu pacjentów/grupę, jednak dokładna liczba pacjentów dla każdej grupy będzie oparta na wykrytym poziomie heterogeniczności.

Badanie ekspresji bezkomórkowych circRNA SMN wyizolowanych z osocza, moczu i płynu mózgowo-rdzeniowego pacjentów z SMA oraz ocena korelacji między stężeniem circRNA SMN a ciężkością choroby. Równolegle oceniając poziom ekspresji liniowych transkryptów SMN2 w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC) dla każdego pacjenta, aby ocenić, czy liniowa ekspresja mRNA SMN2 jest odwrotnie proporcjonalna do biogenezy circRNA SMN i czy ten parametr odpowiada za ekspresję SMN i nasilenie choroby niezależnie od SMN2 skopiuj numer.

Ocena stężenia circRNA SMN zmienia się w czasie u pacjentów z SMA leczonych Nusinersenem poprzez pomiar ich stężenia w płynach ustrojowych przed i po 6 miesiącach podawania leku, zgodnie ze standardowym schematem terapeutycznym stosowanym w naszym Oddziale. W skrócie, Nusinersen będzie podawany we wstrzyknięciach dokanałowych początkowych dawek nasycających (12 mg/5 ml) w dniach 1, 15, 30, 60, a następnie rzadszych dawek podtrzymujących (co 4 miesiące). Ten schemat dawkowania ma na celu zapewnienie odpowiedniego poziomu leku, który utrzymuje się pomiędzy każdą dawką.

Równolegle z badaniem in vivo, testowano wpływ Nusinersen na biogenezę circRNA SMN w przedklinicznych modelach SMA. Ludzkie fibroblasty SMA typu I (GM03813, GM09766 i GM00232; Corriell Institute), które są już dostępne w naszym laboratorium, zostaną transfekowane ISSN1 ASO, który naśladuje efekt leczenia Nusinersenem, a ekspresja circRNA SMN będzie analizowana przez qPCR.

Projekt eksperymentalny Cel 2:

Chociaż około połowa pacjentów z SMA wykazuje znaczną poprawę funkcji motorycznych po leczeniu, wydaje się, że Nusinersen wywiera mniejszy wpływ na innych. W świetle tego, pacjenci z SMA z tymi samymi kryteriami kwalifikacji (liczba kopii SMN2, początek i objawy kliniczne) zostaną podzieleni na trzy podgrupy w oparciu o stężenie krążących bezkomórkowych circRNA SMN (wysokie, pośrednie i niskie) oraz ich reakcję na Nusinersen zostanie oceniony po piątym wstrzyknięciu leku (6 miesięcy po pierwszym podaniu). Kryteriami oceny skuteczności leczenia są HINE (Hammersmith Infant Neurological Examination) i CHOP INTEND (Children Hospital of Philadelphia Infant Test of Nerwmuscular Disorder) dla SMA typu I, w badaniu neurologicznym oraz HFMSE (Hammersmith Functional Motor Scale-Expandend) dla typu II oraz w badaniu neurologicznym HFMSE i 6MWT (6-minutowy test marszu) dla pacjentów typu III. Niniejsze badanie mogłoby również skorzystać z analiz retrospektywnych już przeprowadzonych przez naszą Jednostkę.

Projekt eksperymentalny Cel 3:

Odwrotnej korelacji między liczbą kopii SMN2 a ciężkością choroby nie obserwuje się u wszystkich pacjentów z SMA (tj. przypadki typu III mające 2 kopie SMN2 lub przypadki typu I z 3). Co więcej, nie wszyscy pacjenci z SMA reagują podobnie na terapię Nusinersenem (tj. niezgodne rodzeństwo o tym samym numerze kopii). Na podstawie konkurencji między liniowym i kołowym przetwarzaniem pre-mRNA SMN oceniono, czy różnicowy wskaźnik cyrkulacji SMN (rozumiany jako skłonność pre-mRNA SMN do krążenia) może leżeć u podstaw obserwowanych rozbieżności. W tym celu przeprowadzi analizę sekwencjonowania nowej generacji (Genosplice, Paryż, Francja) całego genu SMN2 z genomowego DNA ~100 pacjentów, u których liczba kopii genu SMN2 nie koreluje z ciężkością fenotypu lub których odpowiedź na leczenie Nusinersenem jest poniżej oczekiwań. W szczególności skupi się na intronowych polimorfizmach SMN2 występujących w odwróconych elementach Alu, które mogą wpływać na wskaźnik cyrkulacji pre-mRNA SMN2.

Ponadto, w celu ustalenia, czy wybrane polimorfizmy intronowe wpływają na biogenezę circRNA SMN, przeprowadzone zostaną eksperymenty mutagenezy in vitro. Mutanty zostaną transfekowane ludzkimi fibroblastami SMA lub HEK293T, a ich skuteczność cyrkulacji zostanie przetestowana za pomocą qPCR pod kątem specyficznych połączeń splicingu wstecznego.

Metodyki i analizy statystyczne:

RNA z osocza pacjentów z SMA będzie ekstrahowane przy użyciu zestawu miRNeasy Serum/Plasma Kit firmy Qiagen (nr kat. NIE. 217184) i po potraktowaniu RNazą R w celu degradacji liniowych RNA przy jednoczesnym zachowaniu circRNA. Zestaw firmy Qiagen polecany jest również do ekstrakcji RNA z innych płynów ustrojowych, np. moczu. Ekspresja circRNA SMN zostanie oceniona za pomocą analiz qPCR przy użyciu starterów specyficznych dla kołowych połączeń splicingowych SMN, wcześniej zidentyfikowanych (patrz Wyniki wstępne). Jako kontrolę wewnętrzną, 100 ng całkowitego RNA C. elegans zostanie sztucznie dodane do każdej próbki płynu ustrojowego przed ekstrakcją RNA.

Dane ilościowe zostaną wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Dwustronny test t-Studenta i analiza wariancji (ANOVA), a następnie test końcowy wielokrotnych porównań Bonferroniego zostaną przeprowadzone przy użyciu oprogramowania Prism 6.0 (oprogramowanie GraphPad).

Oczekiwane rezultaty:

Cel 1: określić ekspresję i stężenie krążących bezkomórkowych circRNA SMN w płynach ustrojowych pacjentów z SMA i zidentyfikować konkretny płyn ustrojowy, w którym jest ich więcej i na którym zostanie przeprowadzona większość poniższych eksperymentów.

Ponadto ocena, czy istnieje bezpośrednia korelacja między stopniem nasilenia patologii SMA a stężeniem circRNA SMN.

Badanie to rzuci również światło na możliwą podwójną rolę tej cząsteczki w liniowej i kolistej ekspresji transkryptu SMN2, ważną kwestię do przetestowania teraz, biorąc pod uwagę, że większość pacjentów otrzymuje już terapię Nusinersen, aw niedalekiej przyszłości rekrutacja nieleczonych pacjentów może być prawie niemożliwe.

Cel 2: ustalenie, czy pacjenci z SMA z wysokim stężeniem bezkomórkowych circRNA SMN mają zmniejszoną odpowiedź na leczenie Nusinersenem, ponieważ cząsteczka ta selektywnie oddziałuje na liniową transkrypcję SMN2.

Cel 3: zidentyfikować ludzkie polimorfizmy intronowe w obrębie odwróconych elementów Alu, które zakłócają biogenezę circRNA SMN i mają wpływ na fenotyp SMA. Co ciekawe, część zidentyfikowanych mutacji może leżeć u podstaw niedopasowania genotyp-fenotyp lub braku odpowiedzi na leczenie Nusinersen u niektórych pacjentów z SMA.

Analiza ryzyka, możliwe problemy i rozwiązania:

Krytycznym punktem projektu jest możliwość, że circRNA SMN są trudne do wykrycia w płynach ustrojowych pacjentów z SMA. W każdym razie duża i rosnąca liczba badań wykazuje obecność licznych i obfitych okrągłych RNA w osoczu pacjentów, co wskazuje na ich rolę jako doskonałych biomarkerów do diagnozy (Li i in., Cell Research, 2015). Zatem jest prawdopodobne, że eksport circRNA jest powszechnym i szeroko rozpowszechnionym procesem, który obejmuje również circRNA SMN. Co więcej, techniki wykrywania RNA w płynnych biopsjach są stale ulepszane, co zmniejsza prawdopodobieństwo niewykrycia circRNA SMN. Pozostała część projektu nie stwarza szczególnego ryzyka ani w odniesieniu do rekrutacji pacjentów z SMA, którzy są już zapisani do Oddziału Pera, ani w zakresie technik molekularnych i komórkowych, które są rutynowo stosowane w Oddziale Pagliariniego. Sekwencjonowanie genomu (Cel 3) wykona firma GenoSplice, lider w dziedzinie analiz sekwencjonowania nowej generacji, który już z nami współpracował przy analizach bioinformatycznych. Niemniej jednak, w najgorszym scenariuszu, jeśli nasze badania wykażą, że circRNA SMN nie są dobrymi biomarkerami, nasz projekt doprowadzi do identyfikacji wariantów genu SMN2 związanych z łagodniejszym i cięższym fenotypem SMA, dostarczając użytecznego narzędzia do przewidywania skuteczności Leczenie Nusinersena.

Znaczenie i innowacja Ze względu na swoje właściwości biochemiczne krążące circRNA SMN mogą stanowić obiecujące biomarkery do przewidywania początku i postępu choroby, a także odpowiedzi klinicznej na leczenie Nusinersenem. Ich stężenie w płynach ustrojowych może stanowić ważny parametr do stratyfikacji pacjentów z SMA, którzy wykazują różne odpowiedzi na Nusinersen pomimo podobnej lub identycznej diagnozy genetycznej. Ponadto nasze badania mogą uwypuklić potrzebę solidnych kombinatorycznych terapii „SMN-plus” dla podgrupy pacjentów, które mogą być wymagane do wygenerowania długotrwałych odpowiedzi u pacjentów z SMA.

Nasz projekt ma również na celu identyfikację ukrytych intronowych wariantów SMN2, które mogą mieć wpływ na ostateczną ilość wytwarzanych transkryptów SMN2 i określać stopień ciężkości fenotypu SMA. Takie ukryte mutacje pozwoliłyby dokładniej przewidzieć fenotyp SMA na podstawie genotypu, a tym samym utorowałyby drogę do rozwoju „spersonalizowanych” terapii, które uwzględniają „indywidualne” różnice.