RNAs circulares SMN como potenciais biomarcadores para a resposta terapêutica ao Nusinersen em pacientes com atrofia muscular espinhal

Histórico/estado da arte A SMA representa a causa genética mais frequente de morte na infância, com uma incidência de aproximadamente 1 em 10.000 nascidos vivos. É uma doença neurodegenerativa autossômica recessiva causada por deleção homozigótica ou mutação pontual no gene SMN1, que codifica a proteína SMN. Níveis reduzidos de SMN causam perda de neurônios motores na medula espinhal e levam a fraqueza muscular progressiva e atrofia em pacientes com AME. Notavelmente, os humanos retêm o gene SMN2 quase idêntico, pois a ausência completa de qualquer forma de SMN é letal embrionário. No entanto, embora SMN2 codifique uma proteína virtualmente idêntica, seus níveis de expressão não são suficientes para restaurar totalmente a atividade de SMN porque uma transição silenciosa C-para-T na posição +6 no exon 7 determina o salto deste exon do mRNA maduro. A proteína SMN7 resultante exibe uma região C-terminal mais curta e é altamente instável. No momento, o Nusinersen é o único medicamento aprovado pela FDA para o tratamento da SMA. É um oligonucleotídeo antisense (ASO) que corrige o splicing do exon 7 de SMN2 mascarando um silenciador de splicing (ISS-N1) no íntron 7 . Embora a administração intratecal de Nusinersen melhore os fenótipos de SMA em pacientes, levando a melhorias substanciais na função motora, nem todos os pacientes com SMA respondem igualmente bem a esta terapia. Assim, a identificação e o desenvolvimento de terapias combinadas e personalizadas que levem em consideração a variabilidade clínica observada entre pacientes do mesmo genótipo são necessários para melhorar o manejo clínico da AME. Devido às suas propriedades bioquímicas (estabilidade, acúmulo durante o envelhecimento, secreção abundante nos fluidos corporais), os RNAs circulares estão emergindo como excelentes e promissores biomarcadores para diagnóstico e prognóstico de inúmeras patologias, como o câncer. Milhares de circRNAs foram descobertos em células eucarióticas e sua expressão é frequentemente regulada de acordo com o tipo de célula e estágio específico. Embora a maioria dos circRNAs ainda careça de anotações funcionais, observações recentes revelaram que eles desempenham alguns papéis potencialmente importantes na regulação de genes. Os RNAs circulares (circRNAs) se originam de um processo de back-splicing do pré-mRNA (isto é, a união covalente de um sítio doador de splicing downstream com um site aceitador de splicing upstream do mesmo gene). Como o splicing canônico e o back-splicing utilizam o mesmo pré-mRNA e são ambos operados pelo spliceossoma, eles provavelmente competem entre si. O principal mecanismo que favorece a circularização do pré-mRNA é a presença de sequências repetitivas em orientação invertida e, em particular, repetições Alu invertidas.

As repetições Alu pertencem à família de retrotransposons Short Interspersed Elements (SINE) específica de primatas. Eles têm aproximadamente 300 nucleotídeos de comprimento e representam até 11% do genoma humano anotado. Sua presença na codificação de genes pode modular a expressão gênica em várias camadas, incluindo transcrição, splicing, exportação e tradução, impactando profundamente na regulação do gene "hospedeiro". O SMN está entre os principais genes humanos para a densidade de Alu, muitos dos quais estão presentes na orientação invertida. Surpreendentemente, Alus conduz a circularização extensa e alternativa do pré-mRNA de SMN, impactando negativamente no potencial de codificação de proteínas do locus. Assim, com base nos resultados preliminares, a proposta será investigar se os circRNAs de SMN livres de células circulantes em fluidos corporais de pacientes com AME representam biomarcadores exibindo poder diagnóstico e prognóstico para prever a resposta clínica à terapia com Nusinersen.

Hipótese e significado:

Os estudos propostos neste projeto visam investigar se os circRNAs SMN representam biomarcadores valiosos para predizer a eficácia de Nusinersen em pacientes com AME que apresentam diferentes graus de gravidade da doença. Em particular, nosso trabalho pode ajudar a estratificar melhor os numerosos pacientes com SMA que não respondem conforme o esperado ao tratamento e/ou para quem o número de cópias do gene SMN2 não se correlaciona com a gravidade fenotípica. Uma vez que a produção extensiva de transcritos circulares SMN, em vez dos transcritos lineares, em alguns pacientes pode reduzir a eficácia de Nusinersen, que atua seletivamente no transcrito linear, nosso estudo também pode destacar a necessidade de terapia combinada para também limitar a circularização do pré-mRNA em tais pacientes. Num futuro próximo, o desenvolvimento de terapias "personalizadas" poderia contornar tais diferenças "individuais" na regulação da expressão de SMN, melhorando assim a resposta clínica de pacientes com AME ao Nusinersen.

Dados preliminares:

A comparação do genoma inteiro da densidade de Alu destacou SMN entre os genes humanos de alto escalão. A inspeção da posição e orientação de Alu em SMN revelou a presença de vários elementos Alu repetidos invertidos interintrônicos (IRAlus) que poderiam mediar a biogênese do circRNA. Nossa análise de bioinformática (dados não mostrados) destacou numerosos IRAlus no íntron 1 e 6, os íntrons mais longos em SMN, favorecendo potencialmente o back-splicing do exon 6 com o exon 2a. De fato, RT-PCR usando iniciadores divergentes no exon 2b e exon 6 seguido de sequenciamento identificou um circRNA em fibroblastos SMA humanos (GM03813) e células HEK293T. Como os eventos de back-splicing ocorrem em detrimento do splicing canônico, foi levantada a hipótese de uma competição entre a biogênese de transcritos circulares e lineares que poderia impactar na expressão da proteína SMN. De acordo com a hipótese, a perda de DHX9, uma helicase que reprime a biogênese do circRNA, aumentou significativamente a expressão de circRNAs SMN e reduziu a expressão da proteína SMN. Além disso, a administração de ASO E8, que mascara um código 5&39; SS no exon 8 que é usado para biogênese de dois circRNAs, mas não para splicing SMN linear, reduziu seletivamente os circRNAs SMN alvo e resgatou a expressão da proteína SMN para ~30% da eficácia do ISSN1 ASO. Esses resultados indicam que os circRNAs de SMN competem com o potencial de codificação de proteínas do locus.

Objetivos Específicos 1:

Identificação de circRNAs SMN livres de células em fluidos corporais de pacientes com SMA como potenciais biomarcadores antes e depois do tratamento com Nusinersen

Objetivos Específicos 2:

Avaliação do poder prognóstico de circRNAs SMN circulantes como preditores da resposta clínica de pacientes com AME ao Nusinersen

Objetivos Específicos 3:

Identificação de polimorfismos intrônicos humanos presentes em elementos Alu invertidos e seu impacto na eficácia do tratamento com Nusinersen

Projeto Experimental Objetivo 1:

Os pacientes com SMA serão inscritos com base na documentação genética de uma deleção ou mutação homozigótica no gene SMN1 e serão agrupados em SMA tipo I (1.1, 1.5 e 1.9), SMA tipo II (de 2,3 a 2,9) e SMA tipo -III (3A e 3B) com base no número de cópias do gene SMN2 e início dos sintomas clínicos. O plano será inscrever dez pacientes/grupo, no entanto, o número exato de pacientes para cada grupo será baseado no nível de heterogeneidade detectado.

Testar a expressão de circRNAs SMN livres de células isolados de plasma, urina e líquido cefalorraquidiano de pacientes com AME e avaliar a correlação entre a concentração de circRNAs SMN e a gravidade da doença. Em paralelo, avaliar o nível de expressão de transcritos lineares de SMN2 em células mononucleadas de sangue periférico (PBMCs) para cada paciente para avaliar se a expressão linear de mRNA de SMN2 está inversamente relacionada à biogênese de circRNA de SMN e se esse parâmetro é responsável pela expressão de SMN e gravidade da doença independentemente de SMN2 número da cópia.

A avaliação da concentração de circRNAs SMN varia ao longo do tempo em pacientes com AME tratados com Nusinersen, medindo sua concentração em fluidos corporais antes e após 6 meses de administração da droga, de acordo com o esquema terapêutico padrão em uso em nossa Unidade. Resumidamente, Nusinersen será administrado com injeção intratecal de doses iniciais de ataque (12mg/5ml) nos dias 1, 15, 30, 60, seguidas por doses de manutenção menos frequentes (a cada 4 meses). Este regime de dosagem é projetado para fornecer um nível adequado de medicamento que é mantido entre cada dose.

Paralelamente ao estudo in vivo, testar os efeitos de Nusinersen na biogênese de circRNAs SMN em modelos pré-clínicos de SMA. Fibroblastos SMA humanos tipo I (GM03813, GM09766 e GM00232; Corriell Institute), já disponíveis em nosso laboratório, serão transfectados com ISSN1 ASO, que mimetiza o efeito do tratamento com Nusinersen, e a expressão de circRNAs SMN será analisada por qPCR.

Projeto Experimental Objetivo 2:

Embora aproximadamente metade dos pacientes com AME apresentem melhorias substanciais na função motora após o tratamento, Nusinersen parece exercer efeitos mais modestos em outros. Diante disso, pacientes com SMA com os mesmos critérios de elegibilidade (número de cópias de SMN2, início e sintomas clínicos) serão estratificados em três subgrupos com base na concentração de circRNAs de SMN livres de células circulantes (alta, intermediária e baixa) e sua capacidade de resposta ao Nusinersen será avaliado após a 5ª injeção do medicamento (6 meses após a primeira administração). Os critérios de avaliação da eficácia do tratamento consistem em HINE (Hammersmith Infant Neurological Examination) e CHOP INTEND (Children Hospital Of Philadelphia Infant Test of Neuromuscular Disorder) para SMA tipo I, no exame neurológico e HFMSE (Hammersmith Functional Motor Scale-Expandend) para tipo- II e no exame neurológico, HFMSE e 6MWT (6 Minute Walk Test) para pacientes do tipo III. Este estudo também poderia se beneficiar de análises retrospectivas já realizadas por nossa Unidade.

Projeto Experimental Objetivo 3:

A correlação inversa entre o número de cópias de SMN2 e a gravidade da doença não é observada em todos os pacientes com AME (ou seja, casos tipo III com 2 cópias de SMN2 ou casos tipo I com 3). Além disso, nem todos os pacientes com AME respondem de forma semelhante à terapia com Nusinersen (ou seja, irmãos discordantes com o mesmo número de cópias). Com base na competição entre o processamento linear e circular do pré-mRNA do SMN, avaliar se um índice diferencial de circularização do SMN (entendido como a propensão do pré-mRNA do SMN para circular) poderia estar por trás dessas discrepâncias observadas. Para isso, será realizada a análise de Sequenciamento de Nova Geração (Genosplice, Paris, França) de todo o gene SMN2 do DNA genômico de ~100 pacientes nos quais o número de cópias do gene SMN2 não se correlaciona com a gravidade fenotípica ou cuja resposta ao tratamento com Nusinersen é abaixo das expectativas. Em particular, ele se concentrará em polimorfismos intrônicos de SMN2 abrigados em elementos Alu invertidos, que podem afetar o índice de circularização do pré-mRNA de SMN2.

Além disso, a fim de determinar se os polimorfismos intrônicos selecionados impactam na biogênese dos circRNAs SMN, serão realizados experimentos de mutagênese in vitro. Os mutantes serão transfectados em fibroblastos SMA humanos ou HEK293T e sua eficiência de circularização será testada por qPCR para junções back-splicing específicas.

Metodologias e análises estatísticas:

O RNA do plasma de pacientes com SMA será extraído usando o kit miRNeasy Serum/Plasma da Qiagen (cat. não. 217184) e depois tratado com RNase R para degradar RNAs lineares preservando circRNAs. O kit da Qiagen também é recomendado para a extração de RNA de outros fluidos corporais, como urina. A expressão de circRNAs SMN será avaliada por análises de qPCR usando primers específicos para as junções de splicing circular SMN, previamente identificadas (ver Resultados Preliminares). Como controle interno, 100 ng de RNA total de C. elegans serão adicionados artificialmente a cada amostra de fluido corporal antes da extração do RNA.

Os dados quantitativos serão expressos como média ± desvio padrão (DP). O teste t de Student bicaudal e a análise de variância (ANOVA) seguidos do pós-teste de comparação múltipla de Bonferroni serão realizados no software Prism 6.0 (GraphPad Software).

Resultados esperados:

Objetivo1: determinar a expressão e concentração de circRNAs SMN livres de células circulantes em fluidos corporais de pacientes com AME e identificar o fluido corporal específico onde eles são mais abundantes e no qual a maioria dos experimentos a seguir serão realizados.

Além disso, avaliar se existe uma correlação direta entre o grau de gravidade da patologia da SMA e a concentração de circRNAs SMN.

Este estudo também lançará luz sobre o possível papel duplo dessa molécula na expressão linear e circular do transcrito SMN2, uma questão importante a ser testada agora, considerando que a maioria dos pacientes já está recebendo terapia com Nusinersen e, em um futuro próximo, o recrutamento de virgens de drogas pacientes pode ser quase impossível.

Objetivo2: determinar se pacientes com SMA com alta concentração de circRNAs de SMN livres de células têm uma capacidade de resposta reduzida ao tratamento com Nusinersen, pois essa molécula atua seletivamente na transcrição linear de SMN2.

Objetivo3: identificar polimorfismos intrônicos humanos, dentro de elementos Alu invertidos, que interferem na biogênese dos circRNAs SMN e têm impacto no fenótipo SMA. Curiosamente, parte das mutações identificadas pode estar subjacente à incompatibilidade genótipo-fenótipo ou à falha de alguns pacientes com SMA em responder ao tratamento com Nusinersen.

Análise de riscos, possíveis problemas e soluções:

Um ponto crítico do projeto é representado pela possibilidade de que circRNAs SMN sejam difíceis de detectar nos fluidos corporais de pacientes com AME. De qualquer forma, um grande e crescente corpo de estudos mostra a presença de numerosos e abundantes RNAs circulares no plasma de pacientes, indicando seu papel como excelentes biomarcadores para diagnóstico (Li et al., Cell Research, 2015). Assim, é provável que a exportação de circRNAs seja um processo comum e generalizado que também envolve circRNAs SMN. Além disso, as técnicas para detectar RNA em biópsias líquidas estão melhorando continuamente, tornando menos provável a impossibilidade de detectar circRNAs SMN. A restante parte do projeto não apresenta riscos particulares nem no recrutamento de doentes com AME, já inscritos na Unidade de Pera, nem nas técnicas moleculares e celulares que são rotineiramente utilizadas na Unidade de Pagliarini. O sequenciamento genômico (objetivo 3) será realizado pela GenoSplice, líder em análises de sequenciamento de próxima geração, que já colaborou conosco em análises de bioinformática. No entanto, no pior cenário, se nossos estudos demonstrarem que os circRNAs SMN não são bons biomarcadores, nosso projeto levará à identificação de variantes do gene SMN2 associadas ao fenótipo SMA mais leve e mais grave, fornecendo uma ferramenta útil para prever a eficácia do Tratamento Nusinersen.

Significado e inovação Devido às suas propriedades bioquímicas, os circRNAs SMN circulantes podem representar biomarcadores promissores para prever o início e a progressão da doença, bem como a resposta clínica ao tratamento com Nusinersen. Sua concentração nos fluidos corporais pode representar um parâmetro válido para estratificar pacientes com AME que exibem diferentes respostas ao Nusinersen, apesar de diagnóstico genético semelhante ou idêntico. Além disso, nossos estudos podem destacar a necessidade de terapias combinatórias robustas 'SMN-plus' para subgrupos de pacientes, o que pode ser necessário para gerar respostas duradouras em pacientes com AME.

Nosso projeto também visa identificar variantes intrônicas ocultas de SMN2 que possam afetar a quantidade final de transcritos de SMN2 produzidos e determinar o grau de gravidade do fenótipo SMA. Essas mutações ocultas permitiriam prever com mais precisão o fenótipo da SMA a partir do genótipo e, assim, abrir caminho para o desenvolvimento de terapias "personalizadas" que considerassem as diferenças "individuais".