Zirkuläre SMN-RNAs als potenzielle Biomarker für das therapeutische Ansprechen auf Nusinersen bei Patienten mit spinaler Muskelatrophie

Hintergrund/Stand der Technik SMA ist mit einer Inzidenz von ~1 von 10.000 Lebendgeburten die häufigste genetische Todesursache im Säuglingsalter. Es handelt sich um eine autosomal-rezessive, neurodegenerative Erkrankung, die durch eine homozygote Deletion oder Punktmutation im SMN1-Gen verursacht wird, das für das SMN-Protein kodiert. Reduzierte SMN-Spiegel verursachen einen Verlust von Motoneuronen im Rückenmark und führen bei SMA-Patienten zu fortschreitender Muskelschwäche und Atrophie. Bemerkenswerterweise behalten Menschen das fast identische SMN2-Gen, da das vollständige Fehlen jeglicher Form von SMN embryonal tödlich ist. Obwohl SMN2 für ein praktisch identisches Protein kodiert, reichen seine Expressionsniveaus nicht aus, um die SMN-Aktivität vollständig wiederherzustellen, da ein translational stummer C-zu-T-Übergang an Position +6 in Exon 7 das Überspringen dieses Exons von der reifen mRNA bestimmt. Das resultierende SMN7-Protein weist eine kürzere C-terminale Region auf und ist sehr instabil. Derzeit ist Nusinersen das einzige von der FDA zugelassene Medikament zur Behandlung von SMA. Es ist ein Antisense-Oligonukleotid (ASO), das das Spleißen von SMN2-Exon 7 korrigiert, indem es einen Splicing Silencer (ISS-N1) in Intron 7 maskiert. Obwohl die intrathekale Verabreichung von Nusinersen die SMA-Phänotypen bei Patienten verbessert und zu erheblichen Verbesserungen der motorischen Funktion führt, sprechen nicht alle SMA-Patienten gleich gut auf diese Therapie an. Daher ist die Identifizierung und Entwicklung kombinierter und personalisierter Therapien, die die klinische Variabilität berücksichtigen, die zwischen Patienten desselben Genotyps beobachtet wird, notwendig, um das klinische Management von SMA zu verbessern. Aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften (Stabilität, Akkumulation während des Alterns, reichliche Sekretion in Körperflüssigkeiten) erweisen sich zirkuläre RNAs nun als hervorragende und vielversprechende Biomarker für die Diagnose und Prognose zahlreicher Pathologien, wie z. B. Krebs. Tausende von circRNAs wurden in eukaryotischen Zellen entdeckt und ihre Expression ist oft zelltyp- und stadienspezifisch reguliert. Obwohl der Mehrheit der circRNAs noch keine funktionellen Anmerkungen vorliegen, haben jüngste Beobachtungen gezeigt, dass sie einige potenziell wichtige Rollen bei der Genregulation spielen. Zirkuläre RNAs (circRNAs) stammen aus einem Rückspleißprozess der Prä-mRNA (d. h. der kovalenten Verbindung einer stromabwärts gelegenen Spleiß-Donorstelle mit einer stromaufwärts gelegenen Spleiß-Akzeptorstelle desselben Gens). Da kanonisches Spleißen und Rückspleißen dieselbe Prä-mRNA verwenden und beide vom Spleißosom betrieben werden, konkurrieren sie wahrscheinlich miteinander. Der Hauptmechanismus, der die Prä-mRNA-Zirkularisierung begünstigt, ist das Vorhandensein repetitiver Sequenzen in invertierter Orientierung und insbesondere invertierter Alu-Wiederholungen.

Alu-Wiederholungen gehören zur Primaten-spezifischen Short Interspersed Elements (SINE)-Familie von Retrotransposons. Sie sind etwa 300 Nukleotide lang und machen bis zu 11 % des annotierten menschlichen Genoms aus. Ihre Anwesenheit in codierenden Genen kann die Genexpression auf mehreren Ebenen modulieren, einschließlich Transkription, Spleißen, Export und Translation, und somit tiefgreifende Auswirkungen auf die Genregulation ihres "Wirts" haben. SMN gehören zu den wichtigsten menschlichen Genen für die Alu-Dichte, von denen viele in umgekehrter Orientierung vorhanden sind. Auffallenderweise treiben Alus eine umfassende und alternative Zirkularisierung der SMN-Prä-mRNA voran und wirken sich somit negativ auf das Protein-kodierende Potenzial des Locus aus. Basierend auf den vorläufigen Ergebnissen soll daher untersucht werden, ob zellfreie SMN-circRNAs, die in Körperflüssigkeiten von SMA-Patienten zirkulieren, Biomarker mit diagnostischer und prognostischer Aussagekraft darstellen, um das klinische Ansprechen auf die Nusinersen-Therapie vorherzusagen.

Hypothese und Bedeutung:

Die in diesem Projekt vorgeschlagenen Studien zielen darauf ab, zu untersuchen, ob SMN-circRNAs wertvolle Biomarker darstellen, um die Wirksamkeit von Nusinersen bei SMA-Patienten mit unterschiedlichem Schweregrad vorherzusagen. Insbesondere kann unsere Arbeit dazu beitragen, die zahlreichen SMA-Patienten, die nicht wie erwartet auf die Behandlung ansprechen und/oder bei denen die Kopienzahl des SMN2-Gens nicht mit dem phänotypischen Schweregrad korreliert, besser zu stratifizieren. Da eine umfangreiche Produktion von zirkulären SMN-Transkripten anstelle der linearen Transkripte bei einigen Patienten die Wirksamkeit von Nusinersen verringern könnte, das selektiv auf das lineare Transkript wirkt, könnte unsere Studie auch die Notwendigkeit einer kombinierten Therapie hervorheben, um auch die Zirkularisierung der prä-mRNA einzuschränken solche Patienten. In naher Zukunft könnte die Entwicklung „personalisierter“ Therapien solche „individuellen“ Unterschiede in der Regulation der SMN-Expression umgehen und so das klinische Ansprechen von SMA-Patienten auf Nusinersen verbessern.

Vorläufige Daten:

Der Gesamtgenomvergleich der Alu-Dichte hob SMN unter den ranghöchsten menschlichen Genen hervor. Die Untersuchung der Alu-Position und -Orientierung in SMN ergab das Vorhandensein mehrerer inter-intronischer Alu-Elemente mit invertierter Wiederholung (IRAlus), die die circRNA-Biogenese vermitteln könnten. Unsere bioinformatische Analyse (Daten nicht gezeigt) hob zahlreiche IRAlus in Intron 1 und 6, den längsten Introns in SMN, hervor, was möglicherweise das Rückspleißen von Exon 6 mit Exon 2a begünstigt. Tatsächlich identifizierte RT-PCR mit divergierenden Primern in Exon 2b und Exon 6, gefolgt von einer Sequenzierung, eine circRNA sowohl in menschlichen SMA-Fibroblasten (GM03813) als auch in HEK293T-Zellen. Da Rückspleißereignisse auf Kosten des kanonischen Spleißens auftreten, wurde eine Konkurrenz zwischen der Biogenese von zirkulären und linearen Transkripten angenommen, die sich auf die SMN-Proteinexpression auswirken könnte. In Übereinstimmung mit der Hypothese erhöhte der Verlust von DHX9, einer Helikase, die die circRNA-Biogenese unterdrückt, die Expression von SMN-circRNAs signifikant und reduzierte die Expression des SMN-Proteins. Darüber hinaus ist die Administration von ASO E8, die ein kryptisches 5&39; SS in Exon 8, das für die Biogenese von zwei circRNAs, aber nicht für das lineare SMN-Spleißen verwendet wird, reduzierte selektiv die Ziel-SMN-circRNAs und rettete die SMN-Proteinexpression auf ~30 % der Wirksamkeit der ISSN1-ASO. Diese Ergebnisse zeigen, dass SMN-circRNAs mit dem proteinkodierenden Potenzial des Locus konkurriert.

Spezifische Ziele 1:

Identifizierung zellfreier SMN-circRNAs in Körperflüssigkeiten von SMA-Patienten als potenzielle Biomarker vor und nach der Behandlung mit Nusinersen

Spezifische Ziele 2:

Bewertung der prognostischen Aussagekraft zirkulierender SMN-circRNAs als Prädiktoren für das klinische Ansprechen von SMA-Patienten auf Nusinersen

Spezifische Ziele 3:

Identifizierung von humanen intronischen Polymorphismen, die in invertierten Alu-Elementen vorhanden sind, und ihre Auswirkung auf die Wirksamkeit der Nusinersen-Behandlung

Experimentelles Design Ziel 1:

SMA-Patienten werden auf der Grundlage der genetischen Dokumentation einer homozygoten Deletion oder Mutation im SMN1-Gen aufgenommen und in SMA-Typ-I (1.1, 1.5 und 1.9), SMA-Typ-II (von 2.3 bis 2.9) und SMA-Typ eingeteilt -III (3A und 3B) basierend auf der Kopienzahl des SMN2-Gens und dem Beginn der klinischen Symptome. Es ist geplant, zehn Patienten/Gruppen aufzunehmen, die genaue Anzahl der Patienten für jede Gruppe basiert jedoch auf dem Grad der festgestellten Heterogenität.

Testen der Expression von zellfreien SMN-circRNAs, die aus Plasma, Urin und Zerebrospinalflüssigkeit von SMA-Patienten isoliert wurden, und Bewertung der Korrelation zwischen SMN-circRNA-Konzentration und Schweregrad der Erkrankung. Parallel dazu Bewertung des Expressionsniveaus linearer SMN2-Transkripte in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) für jeden Patienten, um zu beurteilen, ob die lineare SMN2-mRNA-Expression in umgekehrter Beziehung zur SMN-circRNA-Biogenese steht und ob dieser Parameter unabhängig von SMN2 für die SMN-Expression und den Schweregrad der Erkrankung verantwortlich ist Exemplarnummer.

Die Bewertung der Konzentration von SMN-circRNAs variiert im Laufe der Zeit bei mit Nusinersen behandelten SMA-Patienten, indem ihre Konzentration in Körperflüssigkeiten vor und nach 6 Monaten der Arzneimittelverabreichung gemäß dem in unserer Abteilung verwendeten Standardtherapieschema gemessen wird. Kurz gesagt, Nusinersen wird mit intrathekaler Injektion von anfänglichen Aufsättigungsdosen (12 mg/5 ml) an den Tagen 1, 15, 30, 60 verabreicht, gefolgt von weniger häufigen Erhaltungsdosen (alle 4 Monate). Dieses Dosierungsschema ist so ausgelegt, dass ein angemessener Medikamentenspiegel bereitgestellt wird, der zwischen jeder Dosis aufrechterhalten wird.

Parallel zur In-vivo-Studie wird die Wirkung von Nusinersen auf die Biogenese von SMN-circRNAs in präklinischen Modellen von SMA getestet. Humane Typ-I-SMA-Fibroblasten (GM03813, GM09766 und GM00232; Corriell Institute), die bereits in unserem Labor verfügbar sind, werden mit ISSN1 ASO transfiziert, das die Wirkung der Nusinersen-Behandlung nachahmt, und die SMN-circRNAs-Expression wird durch qPCR analysiert.

Experimentelles Design Ziel 2:

Obwohl etwa die Hälfte der SMA-Patienten nach der Behandlung erhebliche Verbesserungen der motorischen Funktion zeigen, scheint Nusinersen bei anderen bescheidenere Wirkungen auszuüben. Vor diesem Hintergrund werden SMA-Patienten mit den gleichen Eignungskriterien (SMN2-Kopienzahl, Beginn und klinische Symptome) in drei Untergruppen eingeteilt, basierend auf der Konzentration zirkulierender zellfreier SMN-circRNAs (hoch, mittel und niedrig) und ihrer Reaktion auf die Nusinersen wird nach der 5. Injektion des Arzneimittels (6 Monate nach der ersten Verabreichung) bewertet. Bewertungskriterien für die Wirksamkeit der Behandlung bestehen in HINE (Hammersmith Infant Neurological Examination) und CHOP INTEND (Children Hospital of Philadelphia Infant Test of Neuromuscular Disorder) für SMA Typ I, in der neurologischen Untersuchung und HFMSE (Hammersmith Functional Motor Scale-Expandend) für Typ-I II und in der neurologischen Untersuchung, HFMSE und 6MWT (6-Minuten-Gehtest) für Typ-III-Patienten. Diese Studie könnte auch von retrospektiven Analysen profitieren, die bereits von unserer Abteilung durchgeführt wurden.

Experimentelles Design Ziel 3:

Die umgekehrte Korrelation zwischen der Anzahl der SMN2-Kopien und der Schwere der Erkrankung wird nicht bei allen SMA-Patienten beobachtet (d. h. Typ-III-Fälle mit 2 Kopien von SMN2 oder Typ-I-Fälle mit 3). Darüber hinaus sprechen nicht alle SMA-Patienten in ähnlicher Weise auf die Nusinersen-Therapie an (d. h. nicht übereinstimmende Geschwister mit derselben Exemplarnummer). Auf der Grundlage der Konkurrenz zwischen linearer und zirkulärer Verarbeitung von SMN-Prä-mRNA, Bewertung, ob ein unterschiedlicher SMN-Zirkularisierungsindex (verstanden als Zirkulationsneigung von SMN-Prä-mRNA) diesen beobachteten Diskrepanzen zugrunde liegen könnte. Zu diesem Zweck wird es eine Next-Generation-Sequencing-Analyse (Genosplice, Paris, Frankreich) des gesamten SMN2-Gens aus genomischer DNA von etwa 100 Patienten durchführen, bei denen die Kopienzahl des SMN2-Gens nicht mit dem phänotypischen Schweregrad korreliert oder deren Ansprechen auf die Behandlung mit Nusinersen ist unter den Erwartungen. Insbesondere wird es sich auf intronische SMN2-Polymorphismen konzentrieren, die in invertierten Alu-Elementen enthalten sind und den Zirkularisierungsindex von SMN2-Prä-mRNA beeinflussen könnten.

Um zu bestimmen, ob sich die ausgewählten intronischen Polymorphismen auf die Biogenese von SMN-circRNAs auswirken, wird es darüber hinaus In-vitro-Mutagenese-Experimente durchführen. Die Mutanten werden in humane SMA-Fibroblasten oder HEK293T transfiziert und ihre Zirkularisierungseffizienz wird durch qPCR für spezifische Back-Splice-Junctions getestet.

Methoden und statistische Analysen:

Die RNA aus dem Plasma von SMA-Patienten wird mit dem miRNeasy Serum/Plasma Kit von Qiagen (Kat. NEIN. 217184) und nach einer Behandlung mit RNase R zum Abbau linearer RNAs unter Beibehaltung der circRNAs. Das Kit von Qiagen wird auch für die Extraktion von RNA aus anderen Körperflüssigkeiten wie Urin empfohlen. Die Expression von SMN-circRNAs wird durch qPCR-Analysen unter Verwendung von Primern bewertet, die für die zuvor identifizierten kreisförmigen Spleißstellen von SMN spezifisch sind (siehe vorläufige Ergebnisse). Als interne Kontrolle werden 100 ng Gesamt-RNA von C. elegans vor der RNA-Extraktion künstlich in jede Körperflüssigkeitsprobe gegeben.

Die quantitativen Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Der zweiseitige Student-t-Test und die Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Bonferroni's Mehrfachvergleichs-Nachtest, werden unter Verwendung der Prism 6.0-Software (GraphPad-Software) durchgeführt.

Erwartete Ergebnisse:

Ziel 1: Bestimmung der Expression und Konzentration zirkulierender zellfreier SMN-circRNAs in Körperflüssigkeiten von SMA-Patienten und Identifizierung der spezifischen Körperflüssigkeit, in der sie häufiger vorkommen und an der die meisten der folgenden Experimente durchgeführt werden.

Darüber hinaus wird bewertet, ob ein direkter Zusammenhang zwischen dem Schweregrad der SMA-Pathologie und der Konzentration von SMN-circRNAs besteht.

Diese Studie wird auch Aufschluss über die mögliche doppelte Rolle dieses Moleküls bei der linearen und zirkulären SMN2-Transkriptexpression geben, ein wichtiges Thema, das jetzt getestet werden muss, wenn man bedenkt, dass die Mehrheit der Patienten bereits eine Nusinersen-Therapie erhält und in naher Zukunft die Rekrutierung von medikamentennaiven Patienten Patienten könnte fast unmöglich sein.

Ziel 2: Bestimmung, ob SMA-Patienten mit einer hohen Konzentration an zellfreien SMN-circRNAs eine verringerte Reaktion auf die Behandlung mit Nusinersen zeigen, da dieses Molekül selektiv auf die lineare Transkription von SMN2 einwirkt.

Ziel 3: Identifizierung menschlicher intronischer Polymorphismen innerhalb invertierter Alu-Elemente, die die Biogenese von SMN-circRNAs stören und einen Einfluss auf den SMA-Phänotyp haben. Interessanterweise könnte ein Teil der identifizierten Mutationen dem Genotyp-Phänotyp-Missverhältnis oder dem Nichtansprechen einiger SMA-Patienten auf die Behandlung mit Nusinersen zugrunde liegen.

Risikoanalyse, mögliche Probleme und Lösungen:

Ein kritischer Punkt des Projekts stellt die Möglichkeit dar, dass SMN-circRNAs in den Körperflüssigkeiten von SMA-Patienten schwer nachweisbar sind. Jedenfalls zeigt eine große und wachsende Zahl von Studien das Vorhandensein zahlreicher und reichlich vorhandener zirkulärer RNAs im Plasma von Patienten, was auf ihre Rolle als hervorragende Biomarker für die Diagnose hinweist (Li et al., Cell Research, 2015). Daher ist es wahrscheinlich, dass der Export von circRNAs ein üblicher und weit verbreiteter Prozess ist, an dem auch SMN-circRNAs beteiligt sind. Darüber hinaus werden Techniken zum Nachweis von RNA in Flüssigbiopsien kontinuierlich verbessert, wodurch die Möglichkeit, dass SMN-circRNAs nicht nachgewiesen werden können, weniger wahrscheinlich wird. Der verbleibende Teil des Projekts birgt keine besonderen Risiken, weder in Bezug auf die Rekrutierung von SMA-Patienten, die bereits in der Pera-Einheit eingeschrieben sind, noch in Bezug auf die molekularen und zellulären Techniken, die routinemäßig von der Pagliarini-Einheit verwendet werden. Die genomische Sequenzierung (Ziel 3) wird von GenoSplice durchgeführt, einem führenden Anbieter von Next-Generation-Sequencing-Analysen, der bereits mit uns bei bioinformatischen Analysen zusammengearbeitet hat. Im schlimmsten Fall, wenn unsere Studien zeigen, dass SMN-circRNAs keine guten Biomarker sind, wird unser Projekt jedoch zur Identifizierung von SMN2-Genvarianten führen, die mit dem milderen und schwereren SMA-Phänotyp assoziiert sind, und ein nützliches Instrument zur Vorhersage der Wirksamkeit von liefern Nusinersen-Behandlung.

Bedeutung und Innovation Aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften könnten zirkulierende SMN-circRNAs vielversprechende Biomarker darstellen, um den Beginn und das Fortschreiten der Krankheit sowie das klinische Ansprechen auf die Behandlung mit Nusinersen vorherzusagen. Ihre Konzentration in Körperflüssigkeiten könnte einen validen Parameter darstellen, um SMA-Patienten zu stratifizieren, die trotz ähnlicher oder identischer genetischer Diagnose unterschiedlich auf Nusinersen ansprechen. Darüber hinaus könnten unsere Studien den Bedarf an robusten kombinatorischen „SMN-plus“-Therapien für eine Untergruppe von Patienten hervorheben, die möglicherweise erforderlich sind, um lang anhaltende Reaktionen bei SMA-Patienten zu erzielen.

Unser Projekt zielt auch darauf ab, versteckte intronische Varianten von SMN2 zu identifizieren, die die endgültige Menge an produzierten SMN2-Transkripten beeinflussen und den Schweregrad des SMA-Phänotyps bestimmen können. Solche versteckten Mutationen würden eine genauere Vorhersage des SMA-Phänotyps aus dem Genotyp ermöglichen und somit den Weg für die Entwicklung „personalisierter“ Therapien ebnen, die „individuelle“ Unterschiede berücksichtigen.