Strategia interwencyjna w walce z pojawiającą się niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby w otyłości u dzieci

Metodologia Do badania włączono zróżnicowaną grupę uczestników w wieku od 10 do 18 lat, niezależnie od płci, u których zdiagnozowano stłuszczenie wątroby wykryte za pomocą ultrasonografii i nieprawidłowo wysoki poziom transaminazy alaninowej (co najmniej dwukrotnie wyższy niż górne limity dla ich płci). . Badanie składało się z 29 pacjentów, z których 15 otrzymywało dzienną dawkę doustną 50 mg TRF, a 14 otrzymywało placebo przez okres sześciu miesięcy. Monitorowano różne parametry kliniczne, test diagnostyczny LIVERFASt in vitro, fibroscan, parametry biochemiczne, uszkodzenia DNA i ekspresję genów, zarówno na początku, jak i na końcu badania.

Ilość pobranych próbek krwi wynosiła 13 ml przy wejściu i po zakończeniu badania w wieku 6 miesięcy. Szczegóły tych testów przedstawiono poniżej:

Elastografia przejściowa (FibroScan):

Jest to nieinwazyjny test do pomiaru sztywności wątroby, kPa (wskaźnik zwłóknienia wątroby) oraz do wykrywania stopnia nagromadzenia tłuszczu (wartość zakresu CAP 100-400 dB/m), sztywność wątroby > 8kPa wskazuje na zaawansowane zwłóknienie, podczas gdy CAP > 263 wskazuje na stłuszczenie wątroby. Podczas badania uczestnik leżał na łóżku do badań z prawą ręką za głową. Badacz umieszczał sondę między prawymi żebrami pacjenta. Pomiary rejestrowano w urządzeniu (FibroScan® 502 Touch). Badanie przesiewowe jest szybkie i łatwe, zwykle zajmuje mniej niż 15 minut. Zeskanowane stłuszczenie oceniano i oceniano.

Określenie uszkodzenia DNA Interwencję przed i po uszkodzeniu DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu CometAssay Kit (Trevigen, Gaithersburg, USA) zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, komórki krwi w 5 μl pożywki zawieszono w 70 μl ciepłej 0, 6% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMA) (Boehringer Mannheim, Niemcy) (wolnej od DNAzy, wolnej od RNAzy). Szkiełka pozostawiono w buforze alkalicznym na 20 minut, aby umożliwić rozwinięcie nici DNA i ekspresję uszkodzeń nietrwałych w środowisku alkalicznym. Elektroforezę prowadzono przez 20 minut przy 300 mA i 25 V. Po neutralizacji kroplami (TrisHCl, pH 7,5) przez 5 minut, komórki barwiono przez nałożenie 30 μl 1X bromku etydyny. Szkiełka zbadano i zmierzono długość ogona za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Carl Zeiss, Niemcy). Dla każdej próbki zbadano migrację DNA 100 losowo wybranych komórek. Całkowity wynik uszkodzenia określono przez pomnożenie liczby komórek przypisanych do każdego stopnia uszkodzenia przez wartość liczbową stopnia zgodnie z metodami opisanymi przez Heaton i in. [19]. Całkowity wynik uszkodzenia DNA obliczono w następujący sposób. Całkowite uszkodzenie DNA = [(0 × n0) + (1 × n1) + (2 × n2) + (3 × n3) + (4 × n4)] gdzie n0 = komórki z wynikiem 0, n1 = komórki z wynikiem 1, n2 = komórki z wynikiem 2, n3 = komórki z wynikiem 3 i n4 = komórki z wynikiem 4.

Oznaczanie biomarkera i enzymu wątrobowego Poziomy enzymów wątrobowych, w tym aminotransferazy alaninowej, ALT, aminotransferazy asparaginianowej, AST, gamma-glutamylotransferazy, GGT i fosfatazy alkalicznej, ALP, przed i po interwencji określono z próbek krwi pacjentów. Przeanalizowano również inne biomarkery, takie jak profil lipidowy, makroglobulina α-2 i haptoglobina. Próbki krwi zebrano w BD Vacutainer i wirowano przy 1500 xg przez 15 minut w celu oddzielenia surowicy. Surowica była przechowywana w temperaturze -80°C, jeśli nie była poddawana natychmiastowej obróbce. Poziomy enzymów wątrobowych określono stosując ADVIA 1800 (Siemens, USA).

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR):

Całkowity RNA ekstrahowano z próbek krwi pacjentów z NAFLD z tokotrienolem lub bez. Zaprojektowano startery i sondy dla genów TNFα, IL-6 i IFN-gamma. 1 ug/ul całkowitego RNA przekształcono w cDNA, który następnie wykorzystano do reakcji PCR. Wszystkie próbki analizowano w dwóch powtórzeniach. Ekspresję genów określono po znormalizowaniu z genami metabolizmu podstawowego.