Интервенционная стратегия борьбы с возникающей неалкогольной жировой болезнью печени при детском ожирении

Методология. В это исследование была включена разнообразная группа участников в возрасте от 10 до 18 лет, независимо от пола, у которых была диагностирована жировая болезнь печени, обнаруженная с помощью ультразвукового исследования, и аномально высокие уровни аланинтрансаминазы (по крайней мере, в два раза выше, чем верхние пределы для их соответствующего пола). . В исследовании приняли участие 29 пациентов, 15 из которых получали ежедневную пероральную дозу 50 мг TRF, а 14 получали плацебо в течение шести месяцев. Отслеживались различные клинические параметры, диагностический тест LIVERFASt in vitro, фиброскан, биохимические параметры, повреждение ДНК и экспрессия генов как в начале, так и в конце исследования.

Объем взятой пробы крови составлял 13 мл при поступлении и при завершении через 6 месяцев. Детали этих тестов показаны ниже:

Транзиентная эластография (FibroScan):

Это неинвазивный тест для измерения жесткости печени, кПа (индикатор фиброза печени) и для определения степени накопления жира (значение диапазона CAP 100-400 дБ/м), жесткость печени > 8 кПа указывает на выраженный фиброз, в то время как CAP > 263 указывает на ожирение печени. Во время скрининга участник лежал на кушетке, заложив правую руку за голову. Зонд помещался исследователем между правыми ребрами больного. Измерения записывали в машину (FibroScan® 502 Touch). Скрининг проходит быстро и легко, обычно занимает менее 15 минут. Сканированный стеатоз оценивали и оценивали.

Определение повреждения ДНК Определение повреждения ДНК до и после вмешательства проводили с использованием набора CometAssay Kit (Trevigen, Gaithersburg, USA) в соответствии с протоколом производителя. Вкратце, клетки крови в 5 мкл среды суспендировали в 70 мкл теплой 0,6% агарозы с низкой температурой плавления (LMA) (Boehringer Mannheim, Германия) (без ДНКазы, без РНКазы). Предметные стекла оставляли в щелочном буфере на 20 минут, чтобы обеспечить раскручивание цепей ДНК и проявление щелочелабильных повреждений. Электрофорез проводили в течение 20 мин при 300 мА и 25 В. После нейтрализации по каплям (TrisHCl, pH 7,5) в течение 5 минут клетки окрашивали, нанося 30 мкл 1X бромида этидия. Предметные стекла исследовали и измеряли длину хвоста с помощью флуоресцентного микроскопа (Carl Zeiss, Германия). Для каждого образца исследовали миграцию ДНК 100 случайно выбранных клеток. Общий показатель повреждения определяли путем умножения количества клеток, присвоенных каждой степени повреждения, на числовое значение степени в соответствии с методами, описанными Heaton et al. [19]. Общий балл повреждения ДНК рассчитывали следующим образом. Общее повреждение ДНК = [(0 × n0) + (1 × n1) + (2 × n2) + (3 × n3) + (4 × n4)], где n0 = клетки с оценкой 0, n1 = клетки с оценкой 1, n2 = ячейки с оценкой 2, n3 = ячейки с оценкой 3 и n4 = ячейки с оценкой 4.

Определение биомаркера и фермента печени. В образцах крови больных определяли уровни ферментов печени, включая аланинаминотрансферазу, АЛТ, аспартатаминотрансферазу, АСТ, гамма-глутамилтрансферазу, ГГТ и щелочную фосфатазу, ЩФ, до и после вмешательства. Также были проанализированы другие биомаркеры, такие как липидный профиль, макроглобулин α-2 и гаптоглобин. Образцы крови собирали в BD Vacutainer и центрифугировали при 1500 g в течение 15 минут для отделения сыворотки. Сыворотку хранили при -80°C, если она не обрабатывается немедленно. Уровни ферментов печени определяли на приборе ADVIA 1800 (Siemens, США).

Количественная полимеразная цепная реакция (КПЦР):

Тотальную РНК экстрагировали из образцов крови пациентов с НАЖБП с токотриенолом или без него. Были сконструированы праймеры и зонды для генов TNFα, IL-6 и IFN-gamma. 1 мкг/мкл тотальной РНК превращали в кДНК, которую затем использовали для реакции ПЦР. Все образцы анализировали в двух повторностях. Экспрессию генов определяли после нормализации с генами домашнего хозяйства.