Compartimento Endotelial Circulante Durante o Envelhecimento Normal e Patológico (VIMOPEIL)

O sangue será colhido em anticoagulante citratado ou EDTA e processado dentro de uma hora para determinação de Plaquetas de Micropartículas Endoteliais (EMP), Células Endoteliais Circulantes (CEC) e Progenitores Endoteliais Circulantes (EPC).

Métodos para determinação de marcadores endoteliais:

• Micropartículas endoteliais O plasma livre de plaquetas (PFP) será preparado por centrifugação em dupla etapa de sangue citratado a 1.500g por 15 min e 13.000 g por 2 min em temperatura ambiente. Em seguida, o EMP será enumerado por citometria de fluxo após a marcação de PFP usando anticorpos monoclonais direcionados contra antígenos endoteliais, como CD144 (19). Para investigar a proporção de EMP dentro de todo o MP circulante, o MP para origens de plaquetas, leucócitos e eritrócitos será determinado usando, respectivamente, CD41, CD45, anticorpos direcionados à glicoforina, e o número total de fosfatidilserina expressando MP será determinado usando a ligação de Anexina V.
• O CEC será enumerado usando a metodologia consensual baseada em um ensaio de separação imunomagnética (20). A CEC será isolada do sangue total com EDTA utilizando esferas magnéticas revestidas com anticorpos dirigidos contra o antígeno CD146. As células isoladas serão identificadas usando critérios adicionais, como morfologia, tamanho superior a 15µm, rosetas celulares com mais de 5 esferas e expressão de marcadores endoteliais (ligação à lectina).

• Para EPC, duas abordagens complementares serão usadas para determinação:

  1. Citometria de fluxo após imunomarcação direta de sangue total ou fração de células mononucleares usando anticorpos monoclonais e marcador de viabilidade 7AAD. Devido à falta de marcadores específicos para EPC e à grande heterogeneidade de células que recuperaram as características de EPC21, a análise por citometria de fluxo incluirá a numeração de diferentes populações celulares correspondentes ao estado de diferenciação de EPC: células CD34+CD133+ e células CD34+KDR+. Os progenitores hematopoiéticos circulantes CD34+CD45+ também serão numerados.-
  2. Ensaios clonogênicos que permitem a contagem de Unidade Formadora de Colônias após cultivo ex vivo de EPC incluindo: - CFU-EC, que são EPC do subtipo mielóide (também chamado de EPC inicial) serão determinados de acordo com o método descrito anteriormente de Hill et al. A fração não aderente de células mononucleares será semeada em placas revestidas com fibronectina em meio Endocult®. o número de colônias endoteliais será contado após 48h de cultura - High Proliferative Potencial UFC, que são verdadeiros angioblastos, será determinado pelo método de Ingram (21). As células mononucleares são semeadas em placas revestidas com fibronectina em meio de cultura EGM-2MV e as colônias EPC tardias são enumeradas após 10-15 dias de cultura. - ensaio de metilcelulose tridimensional em que o único fator de crescimento adicionado é o VEGF. As CFU-EC são numeradas após 14 dias, como geralmente é realizado para células-tronco hematopoiéticas. Efeito da hipóxia no equilíbrio entre o dano endotelial e o reparo De acordo com Ingram, o endotélio vascular normal contém EPC de alta potência proliferativa (22) sugerindo que as EPC tardias também podem se originar da parede do vaso. Além disso, a hipóxia local também pode mobilizar a CEP (23).

Desenhamos um protocolo cujos objetivos específicos são 1/ testar o efeito da hipóxia local nos marcadores de dano endotelial/reparação do equilíbrio 2/ definir se em pacientes idosos a isquemia local pode ser usada para mobilizar CPE e aumentar seu potencial de proliferação em comparação a EPC isoladas em condições de repouso. Dois grupos de voluntários saudáveis ​​com idades entre 20-30 e 60-70 anos de nossas coortes serão submetidos à isquemia transitória do antebraço conforme descrito por Friedrich et al (23). Amostras de sangue periférico serão obtidas antes e após 10 min de oclusão venosa realizada com uma pressão de manguito intermediária entre a pressão sistólica e diastólica (24). EPC, CEC e EMP serão enumerados de acordo com os métodos descritos acima e EPC será testado quanto à capacidade de proliferação em cada ponto de tempo. O fenótipo arterial das artérias condutoras será avaliado, pela vasodilatação aguda mediada pelo fluxo (FMD) e vasodilatação independente do endotélio (EIV) da artéria braquial (AB) em voluntários jovens e idosos saudáveis ​​usando um sistema de ecorastreamento de alta resolução. A eficiência da oclusão venosa será avaliada pela liberação de t-PA pelas células endoteliais.