Cirkulující endoteliální kompartment během normálního a patologického stárnutí (VIMOPEIL)

Krev bude odebrána v citrátovém nebo EDTA antikoagulantu a zpracována do jedné hodiny pro stanovení endoteliálních mikročásticových destiček (EMP), cirkulujících endoteliálních buněk (CEC) a cirkulujících endoteliálních progenitorů (EPC).

Metody stanovení endoteliálních markerů:

• Endoteliální mikročástice Plazma bez krevních destiček (PFP) bude připravena dvoukrokovou centrifugací citrátové krve při 1500 g po dobu 15 minut a 13 000 g po dobu 2 minut při pokojové teplotě. Poté bude EMP spočítána průtokovou cytometrií po značení PFP pomocí monoklonálních protilátek namířených proti endoteliálním antigenům, jako je CD144 (19). Pro zkoumání podílu EMP v celém cirkulujícím MP se stanoví MP pro původ krevních destiček, leukocytů a erytrocytů pomocí CD41, CD45, protilátek řízených glykoforinem a celkový počet MP exprimujících fosfatidylserin se stanoví pomocí vazby AnnexinV.
• CEC bude vyčíslena pomocí konsenzuální metodologie založené na imunomagnetické separační zkoušce (20). CEC bude izolována z plné krve EDTA pomocí magnetických kuliček potažených protilátkami namířenými proti antigenu CD146. Izolované buňky budou identifikovány pomocí dalších kritérií, jako je morfologie, velikost vyšší než 15 um, buněčné růžice nesoucí více než 5 kuliček a exprese endoteliálních markerů (vazba lektinu).

• Pro EPC budou pro stanovení použity dva komplementární přístupy:

  1. Průtoková cytometrie po přímém imunoznačení plné krve nebo frakce mononukleárních buněk pomocí monoklonálních protilátek a markeru životaschopnosti 7AAD. Kvůli nedostatku specifických markerů pro EPC a velké heterogenitě buněk, které obnovily rysy EPC21 průtoková cytometrická analýza, bude zahrnovat číslování různých buněčných populací odpovídajících diferenciačnímu stavu EPC: CD34+CD133+ buňky a CD34+KDR+ buňky. Cirkulující hematopoetické progenitory CD34+CD45+ budou také očíslovány.-
  2. Klonogenní testy umožňující očíslování Colony Forming Unit po ex vivo kultivaci EPC zahrnující: - CFU-EC, což jsou EPC myeloidního subtypu (také nazývané rané EPC), budou stanoveny podle dříve popsané metody Hill et al. Neadherentní frakce mononukleárních buněk se nanese na misky potažené fibronektinem v médiu Endocult®. počet endoteliálních kolonií bude spočítán po 48hodinové kultivaci – CFU s vysokým proliferačním potenciálem, což jsou pravé angioblasty, bude stanovena Ingramovou metodou (21). Mononukleární buňky se nanesou na plotny potažené fibronektinem v kultivačním médiu EGM-2MV a kolonie pozdních EPC se spočítají po 10-15 dnech kultivace. - trojrozměrný methylcelulózový test, ve kterém je jediným přidaným růstovým faktorem VEGF. CFU-EC jsou číslovány po 14 dnech, jak se obvykle provádí pro hematopoetické kmenové buňky. Vliv hypoxie na rovnováhu mezi poškozením a reparací endotelu Podle Ingrama obsahuje normální vaskulární endotel EPC s vysokou proliferační potencí (22), což naznačuje, že pozdní EPC může také pocházet z cévní stěny. Kromě toho může EPC mobilizovat také lokální hypoxie (23).

Navrhli jsme protokol, jehož konkrétními cíli jsou 1/ otestovat účinek lokální hypoxie na markery rovnováhy poškození/opravy endotelu 2/ definovat, zda u starších pacientů lze lokální ischemii použít k mobilizaci EPC a ke zvýšení jejich proliferačního potenciálu. na EPC izolovaný v klidových podmínkách. Dvě skupiny zdravých dobrovolníků ve věku 20-30 a 60-70 let z našich kohort budou podrobeny přechodné ischemii předloktí, jak je popsáno Friedrichem et al (23). Vzorky periferní krve budou odebrány před a po 10 minutách žilní okluze provedené s tlakem manžety uprostřed mezi systolickým a diastolickým tlakem [24]. EPC, CEC a EMP budou vyčísleny podle metod popsaných výše a EPC bude testována na proliferační kapacitu v každém časovém bodě. Arteriální fenotyp vodivých tepen bude hodnocen akutní průtokově zprostředkovanou vazodilatací (FMD) a endotelově nezávislou vazodilatací (EIV) brachiální tepny (BA) u mladých a starších zdravých dobrovolníků pomocí systému echotrackingu s vysokým rozlišením. Účinnost žilní okluze bude hodnocena uvolňováním t-PA endoteliálními buňkami.