Compartimento endoteliale circolante durante l'invecchiamento normale e patologico (VIMOPEIL)

Il sangue verrà raccolto in anticoagulante citrato o EDTA e processato entro un'ora per la determinazione delle piastrine delle microparticelle endoteliali (EMP), delle cellule endoteliali circolanti (CEC) e dei progenitori endoteliali circolanti (EPC).

Metodi per la determinazione del marcatore endoteliale:

• Microparticelle endoteliali Il plasma libero da piastrine (PFP) sarà preparato mediante una doppia centrifugazione di sangue citrato a 1.500 g per 15 min e 13.000 g per 2 min a temperatura ambiente. Quindi l'EMP sarà enumerato mediante citometria a flusso dopo la marcatura della PFP usando anticorpi monoclonali diretti contro antigeni endoteliali, come CD144 (19). Per studiare la proporzione di EMP all'interno dell'intera MP circolante, la MP per le origini piastriniche, leucocitarie ed eritrocitarie sarà determinata usando rispettivamente, CD41, CD45, anticorpi diretti contro la glicoforina, e il numero totale di fosfatidilserina che esprime MP sarà determinato usando il legame dell'annessina V.
• I CEC saranno enumerati utilizzando la metodologia consensuale basata su un saggio di separazione immunomagnetica (20). Il CEC sarà isolato dal sangue intero EDTA usando biglie magnetiche rivestite con anticorpi diretti contro l'antigene CD146. Le cellule isolate saranno identificate utilizzando criteri aggiuntivi come la morfologia, dimensioni superiori a 15 µm, rosette cellulari con più di 5 biglie e l'espressione di marcatori endoteliali (lectina).

• Per l'EPC verranno utilizzati due approcci complementari per la determinazione:

  1. Citometria a flusso dopo immunomarcatura diretta del sangue intero o della frazione di cellule mononucleari utilizzando anticorpi monoclonali e marcatore di vitalità 7AAD. A causa della mancanza di marcatori specifici per EPC e della grande eterogeneità delle cellule che hanno recuperato le caratteristiche della citometria a flusso EPC21, l'analisi includerà la numerazione di diverse popolazioni cellulari corrispondenti allo stato di differenziazione di EPC: cellule CD34+CD133+ e cellule CD34+KDR+. Verranno numerati anche i progenitori emopoietici circolanti CD34+CD45+.-
  2. Saggi clonogenici che consentano la numerazione delle Colony Forming Unit dopo coltura ex vivo di EPC comprendenti: - CFU-EC, che sono EPC del sottotipo mieloide (chiamato anche EPC precoce) saranno determinati secondo il metodo precedentemente descritto da Hill et al. La frazione non aderente di cellule mononucleate sarà piastrata su piatti rivestiti di fibronectina in terreno Endocult®. il numero di colonie endoteliali sarà contato dopo una coltura di 48 ore - L'alto potenziale proliferativo CFU, che sono veri angioblasti, sarà determinato con il metodo di Ingram (21). Le cellule mononucleate vengono piastrate su piastre rivestite di fibronectina in terreno di coltura EGM-2MV e le colonie EPC tardive vengono enumerate dopo 10-15 giorni di coltura. - saggio tridimensionale della metilcellulosa in cui l'unico fattore di crescita aggiunto è il VEGF. Le CFU-EC vengono numerate dopo 14 giorni come di consueto per le cellule staminali emopoietiche. Effetto dell'ipossia sull'equilibrio tra danno endoteliale e riparazione Secondo Ingram, l'endotelio vascolare normale contiene EPC ad alta potenza proliferativa (22) suggerendo che anche l'EPC tardivo può originarsi dalla parete del vaso. Inoltre, l'ipossia locale potrebbe anche mobilitare EPC (23).

Abbiamo progettato un protocollo i cui obiettivi specifici sono 1/ testare l'effetto dell'ipossia locale sui marcatori dell'equilibrio danno/riparazione endoteliale 2/ definire se nei pazienti anziani l'ischemia locale può essere utilizzata per mobilizzare le EPC e aumentare il loro potenziale di proliferazione rispetto a EPC isolate in condizioni di riposo. Due gruppi di volontari sani di età compresa tra 20-30 e 60-70 anni delle nostre coorti saranno sottoposti a ischemia transitoria dell'avambraccio come descritto da Friedrich et al (23). I campioni di sangue periferico saranno prelevati prima e dopo 10 minuti di occlusione venosa eseguita con una pressione del bracciale a metà tra la pressione sistolica e diastolica (24). EPC, CEC ed EMP saranno enumerati secondo i metodi descritti sopra e EPC sarà testato per la capacità di proliferazione in ogni punto temporale. Il fenotipo arterioso delle arterie conduttrici sarà valutato mediante vasodilatazione acuta flusso-mediata (FMD) e vasodilatazione endotelio-indipendente (EIV) dell'arteria brachiale (BA) in volontari sani giovani e anziani utilizzando un sistema di tracciamento ecografico ad alta risoluzione. L'efficienza dell'occlusione venosa sarà valutata dal rilascio di t-PA da parte delle cellule endoteliali.