Circulerend endotheelcompartiment tijdens normale en pathologische veroudering (VIMOPEIL)

Bloed zal worden geoogst in citraat- of EDTA-anticoagulans en binnen een uur worden verwerkt voor bepaling van endotheliale microdeeltjesplaatjes (EMP), circulerende endotheelcellen (CEC) en circulerende endotheliale progenitors (EPC).

Methoden voor bepaling van endotheelmarkers:

• Endotheliale microdeeltjes Bloedplaatjesvrij plasma (PFP) zal worden bereid door middel van een dubbelstapscentrifugering van gecitreerd bloed bij 1.500 g gedurende 15 minuten en 13.000 g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens wordt EMP geteld door middel van flowcytometrie na labeling van PFP met behulp van monoklonale antilichamen gericht tegen endotheelantigenen, zoals CD144 (19). Om het aandeel van EMP binnen het gehele circulerende MP te onderzoeken, zal MP voor de oorsprong van bloedplaatjes, leukocyten en erytrocyten worden bepaald met behulp van respectievelijk CD41, CD45, Glycophorin-gerichte antilichamen, en het totale aantal fosfatidylserine tot expressie brengende MP zal worden bepaald met behulp van AnnexinV-binding.
• CEC zal worden geteld met behulp van de consensuele methode op basis van een immunomagnetische scheidingstest (20). CEC zal worden geïsoleerd uit EDTA-volbloed met behulp van magnetische korrels die zijn gecoat met antilichamen die zijn gericht tegen het CD146-antigeen. Geïsoleerde cellen zullen worden geïdentificeerd aan de hand van aanvullende criteria zoals morfologie, grootte groter dan 15 µm, celrozetten met meer dan 5 bolletjes en expressie van endotheelmarkers (lectinebinding).

• Voor EPC zullen twee complementaire benaderingen worden gebruikt voor bepaling:

  1. Flowcytometrie na directe immunolabeling van volbloed of de mononucleaire celfractie met behulp van monoklonale antilichamen en levensvatbaarheidsmarker 7AAD. Vanwege het ontbreken van specifieke markers voor EPC en de grote heterogeniteit van cellen die de kenmerken van EPC21 hebben hersteld, zal flowcytometrieanalyse de nummering van verschillende celpopulaties omvatten die overeenkomen met de differentiatiestatus van EPC: CD34+CD133+-cellen en CD34+KDR+-cellen. De circulerende hematopoëtische voorlopercellen CD34+CD45+ zullen ook worden genummerd.-
  2. Klonogene assays die de nummering van Colony Forming Unit mogelijk maken na ex vivo kweken van EPC, waaronder: - CFU-EC, die EPC zijn van het myeloïde subtype (ook wel vroege EPC genoemd) zullen worden bepaald volgens de eerder beschreven methode van Hill et al. De niet-adherente fractie van mononucleaire cellen zal worden uitgeplaat op met fibronectine gecoate schaaltjes in Endocult®-medium. het aantal endotheliale kolonies zal worden geteld na een kweek van 48 uur - High Proliferative Potential CFU, die echte angioblasten zijn, zal worden bepaald met de methode van Ingram (21). Mononucleaire cellen worden uitgeplaat op met fibronectine beklede platen in EGM-2MV-kweekmedium en late EPC-kolonies worden geteld na 10-15 dagen kweken. - driedimensionale methylcellulose-assay waarbij de enige toegevoegde groeifactor VEGF is. De CFU-EC worden na 14 dagen genummerd, zoals gewoonlijk wordt gedaan voor hematopoëtische stamcellen. Effect van hypoxie op het evenwicht tussen endotheelbeschadiging en -herstel Volgens Ingram bevat het normale vasculaire endotheel EPC met een hoog prolifererend vermogen (22), wat suggereert dat late EPC ook afkomstig kan zijn van de vaatwand. Bovendien kan lokale hypoxie ook EPC mobiliseren (23).

We hebben een protocol ontworpen met als specifieke doelstellingen: 1/ het effect testen van lokale hypoxie op de markers van endotheelbeschadiging/evenwicht herstellen 2/ bepalen of bij oudere patiënten lokale ischemie kan worden gebruikt om EPC te mobiliseren en hun proliferatiepotentieel te vergroten in vergelijking met naar EPC geïsoleerd in rustomstandigheden. Twee groepen gezonde vrijwilligers van 20-30 en 60-70 jaar uit onze cohorten zullen onderworpen worden aan voorbijgaande ischemie van de onderarm, zoals beschreven door Friedrich et al (23). Perifere bloedmonsters zullen worden verkregen voor en na 10 minuten veneuze occlusie, uitgevoerd met een manchetdruk halverwege tussen systolische en diastolische druk (24). EPC, CEC en EMP zullen worden opgesomd volgens de hierboven beschreven methoden en EPC zal op elk tijdstip worden getest op proliferatiecapaciteit. Het arteriële fenotype van geleidende arteriën zal geëvalueerd worden, door de acute flow-gemedieerde vasodilatatie (FMD) en endotheel-onafhankelijke vasodilatatie (EIV) van de arteria brachialis (BA) bij jonge en oudere gezonde vrijwilligers met behulp van een echotrackingsysteem met hoge resolutie. De efficiëntie van veneuze occlusie zal worden geëvalueerd door de afgifte van t-PA door endotheelcellen.