Este é um estudo observacional de 6 meses. Os pacientes incluídos serão aqueles encaminhados com um possível diagnóstico ou diagnóstico estabelecido de asma. Ele analisará a associação do microbioma da asma e as características da doença, a gravidade e a resposta ao tratamento.

VISITA 1 (Mês 0) PRESENCIAL

• Uma vez consentido, um ID do estudo será atribuído e informações demográficas básicas serão coletadas.
• Um histórico médico padronizado será obtido para incluir histórico de sintomas alvo, frequência de exacerbações e internações hospitalares.
• Uma história detalhada de comorbidade será obtida, assim como uma revisão de todos os tratamentos anteriores para asma. Questionários de sintomas validados serão preenchidos durante as visitas do estudo.
• Todos os participantes receberão um monitor eletrônico PEFR.
• Os pacientes em terapia inalada ou planejados receberão um monitor eletrônico de adesão.
• Os testes de função pulmonar serão realizados incluindo espirometria, oscilometria de impulso, fração de óxido nítrico exalado juntamente com reversibilidade do broncodilatador.
• A coleta de amostras incluirá sangue, enxágue oral, esfregaço nasofaríngeo, condensado do hálito exalado, fezes e escarro induzido.
• Um subconjunto de pacientes será consentido para broncoscopia para amostragem das vias aéreas inferiores.

VISITA 2,3, 4 (Mês 1,2, 3) PRESENCIALMENTE

• Um histórico detalhado dos sintomas será obtido, assim como uma revisão de todas as alterações no tratamento.
• Questionários de sintomas validados serão preenchidos durante as visitas do estudo.
• Os dados do PEFR e dos dispositivos de adesão do mês anterior serão coletados e novos monitores e dispositivos serão fornecidos quando necessário.
• O teste de função pulmonar será realizado conforme acima.
• A coleta de amostras incluirá sangue, enxágue oral, esfregaço nasofaríngeo, EBC, fezes e escarro induzido conforme acima.

VISITA 5 (Mês 6) PRESENCIAL

• Um histórico detalhado dos sintomas será obtido, assim como uma revisão de todas as alterações no tratamento. - Questionários de sintomas validados serão preenchidos durante as visitas do estudo.
• Os dados do PEFR e dos dispositivos de adesão do mês anterior serão coletados e novos monitores e dispositivos serão fornecidos quando necessário.
• O teste de função pulmonar será realizado conforme acima.
• A coleta de amostras incluirá sangue, enxágue oral, esfregaço nasofaríngeo, EBC, fezes e escarro induzido.
• Um subconjunto de pacientes que fizeram broncoscopia na VISITA 1 terá a broncoscopia realizada novamente para coleta de amostra correspondente.

PROCEDIMENTOS:

Questionários:

Os questionários de sintomas validados serão preenchidos durante as visitas do estudo indicadas anteriormente. O Teste de Controle da Asma mede a adequação do controle da asma e a mudança no controle da asma que pode ocorrer espontaneamente ou em resposta ao tratamento. O GERD-Q e o SNOT-22 estabelecem a presença e gravidade da doença do refluxo gastroesofágico e da sinusite comórbidas, ambas comorbidades comuns da asma, que podem afetar a qualidade de vida, o controle dos sintomas e a resposta ao tratamento.

Investigações:

Os testes de função pulmonar incluirão espirometria, oscilometria de impulso (IOS), medição da taxa de fluxo expiratório máximo (PEFR). A fração de óxido nítrico exalado (FeNO), um biomarcador estabelecido medido rotineiramente em clínicas de asma, também será medida.

Bio-amostras:

Amostras de fundo serão coletadas de equipamentos de amostragem e armazenamento para examinar a contaminação ambiental, incluindo solução salina estéril, esfregaço nasofaríngeo, recipiente para enxágue oral/escarro e broncoscópio.

Os exames de sangue serão coletados por meio de flebotomia e passagem de agulha única. A quantidade total de volume sanguíneo coletado será o volume minimamente aceitável usado em pacientes pediátricos para fins de pesquisa. O volume total máximo da amostra é de 50ml/10 colheres de chá.

Amostras orais serão coletadas usando um procedimento padronizado de acordo com o Manual de Procedimentos para Projeto de Microbioma Humano. Os participantes do estudo enxaguarão a boca (swish/gargarejo) com 15 mL de solução salina normal estéril por 1 min e expectorarão o conteúdo da boca em um tubo de centrífuga de 50 mL. A amostra deve ser mantida resfriada em gelo até o processamento.

O esfregaço nasofaríngeo será coletado e inserido em cada narina por vários segundos.

O escarro induzido será coletado em pacientes selecionados usando solução salina hipertônica quando necessário.

O EBC será coletado usando RTube onde uma válvula respiratória unidirecional que permite a coleta livre de contaminantes de 200 microlitros por minuto em adultos durante a respiração normal.

As fezes serão coletadas em um recipiente lacrado e armazenadas a -80ºC para processamento posterior.

A broncoscopia será realizada sob sedação moderada com anestesia tópica. Uma pequena câmera é passada através das cordas vocais até as vias aéreas superiores e inferiores. Para um lavado broncoalveolar (LBA) um total de 60ml de solução salina normal será instilado em um lobo pulmonar e o retorno será coletado para análise. Uma escovação endotelial (EB) envolve a introdução de uma pequena escova através do broncoscópio para escovar suavemente as paredes das vias aéreas para coletar células epiteliais para análise para estudos morfológicos e funcionais.

PROCESSAMENTO DE AMOSTRA:

As amostras serão processadas e armazenadas no RCSI. Depois de todas coletadas, as amostras disponíveis serão transferidas para os Hospitais da Universidade de Nova York (para nosso colaborador Dr. Leopoldo Segal), para serem processadas para perfil de microbioma e transcriptoma do hospedeiro.

Amostras de sangue serão processadas para hemograma completo, imunoglobulina E e sensibilidade a aeroalérgenos. Além disso, o sangue será processado para o perfil imunológico do hospedeiro.

Controle de fundo, enxágue oral, esfregaço nasofaríngeo, EBC, escarro induzido e amostras de fezes serão processadas para microbioma. EBC e escarro induzido também serão processados ​​para o perfil imunológico do hospedeiro.

Da coorte de broncoscopia, todas as amostras coletadas serão submetidas à análise do microbioma. Também realizaremos o perfil imunológico do hospedeiro em amostras de BAL. Escovas endobrônquicas serão processadas para análise do transcriptoma do hospedeiro.

• Perfil imunológico do hospedeiro: a análise de citocinas das amostras será feita pelo Luminex multiplex
• Sequenciamento do gene 16S rRNA (microbioma): Extração de ácido nucleico, amplificação do gene 16S rRNA e purificação serão realizadas e o sequenciamento será realizado em uma plataforma MiSeq (Illumina). Esses dados serão analisados ​​com Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME).
• Bulk RNAseq (transciptome hospedeiro): RNAseq será realizado em células epiteliais brônquicas obtidas por escovado brônquico (EB), utilizando a plataforma Hi-seq/Illumina. As sequências serão alinhadas com o genoma de referência do conjunto hg19, a contagem genética subsequente será realizada usando featureCounts e a expressão gênica diferencial será calculada usando o pacote DESeq2 com um valor de p ajustado <0,05. A Ingenuity Pathway Analysis (IPA) será usada para identificar as principais funções biológicas. Os genes serão mapeados para IDs Ensembl e posteriormente para vias KEGG. Também usaremos abordagens analíticas destinadas a estabelecer um perfil imunológico como o CIBERSORT.