Jest to 6-miesięczne badanie obserwacyjne. Uwzględnieni zostaną pacjenci skierowani z możliwą lub potwierdzoną diagnozą astmy. Uwzględnione zostanie Stowarzyszenie Mikrobiomu Astmy i Charakterystyki Chorób, Ciężkości i Odpowiedzi na Leczenie.

WIZYTA 1 (miesiąc 0) TWARZ W TWARZ

• Po wyrażeniu zgody zostanie przypisany identyfikator badania i pobrane zostaną podstawowe dane demograficzne.
• Zostanie zebrany ustandaryzowany wywiad chorobowy obejmujący historię docelowych objawów, częstość zaostrzeń i hospitalizacje.
• Zostanie zebrany szczegółowy wywiad dotyczący chorób współistniejących oraz przegląd wszystkich wcześniejszych metod leczenia astmy. Podczas wizyt w ramach badania zostaną wypełnione zatwierdzone kwestionariusze dotyczące objawów.
• Wszyscy uczestnicy otrzymają elektroniczny monitor PEFR.
• Pacjenci stosujący lub planujący terapię wziewną otrzymają elektroniczny monitor przestrzegania zaleceń.
• Przeprowadzone zostaną badania czynności płuc, obejmujące spirometrię, oscylometrię impulsową, badanie frakcji wydychanego tlenku azotu oraz ocenę odwracalności działania leku rozszerzającego oskrzela.
• Pobieranie próbek obejmie krew, płukanie jamy ustnej, wymaz z nosogardzieli, kondensat wydychanego powietrza, kał i indukowaną plwocinę.
• Część pacjentów zostanie wyrażona zgodę na wykonanie bronchoskopii w celu pobrania próbek z dolnych dróg oddechowych.

WIZYTA 2,3,4 (miesiące 1,2,3) TWARZ W TWARZ

• Zostanie zebrany szczegółowy wywiad dotyczący objawów oraz przegląd wszystkich zmian w leczeniu.
• Podczas wizyt w ramach badania zostaną wypełnione zatwierdzone kwestionariusze dotyczące objawów.
• Zostaną zebrane dane dotyczące PEFR i urządzeń przylegających z poprzedniego miesiąca, a w razie potrzeby dostarczone zostaną nowe monitory i urządzenia.
• Badanie czynności płuc zostanie przeprowadzone jak powyżej.
• Pobieranie próbek będzie obejmowało krew, płukanie jamy ustnej, wymaz z nosogardzieli, EBC, kał i indukowaną plwocinę, jak opisano powyżej.

WIZYTA 5 (miesiąc 6) TWARZĄ W TWARZ

• Zostanie zebrany szczegółowy wywiad dotyczący objawów oraz przegląd wszystkich zmian w leczeniu. - Podczas wizyt w ramach badania zostaną wypełnione zatwierdzone kwestionariusze dotyczące objawów.
• Zostaną zebrane dane dotyczące PEFR i urządzeń przylegających z poprzedniego miesiąca, a w razie potrzeby dostarczone zostaną nowe monitory i urządzenia.
• Badanie czynności płuc zostanie przeprowadzone jak powyżej.
• Pobieranie próbek obejmie krew, płukanie jamy ustnej, wymaz z nosogardzieli, EBC, kał i indukowaną plwocinę.
• U części pacjentów, u których wykonano bronchoskopię podczas VISIT 1, zostanie ponownie wykonana bronchoskopia w celu pobrania odpowiedniej próbki.

PROCEDURY:

Kwestionariusze:

Zatwierdzone kwestionariusze dotyczące objawów zostaną wypełnione podczas wskazanych wcześniej wizyt badawczych. Test kontroli astmy mierzy adekwatność kontroli astmy i zmiany w kontroli astmy, które mogą wystąpić samoistnie lub w odpowiedzi na leczenie. Skale GERD-Q i SNOT-22 ustalają obecność i nasilenie współistniejącej choroby refluksowej przełyku i choroby zatok, obu częstych chorób współistniejących z astmą, które mogą wpływać na jakość życia, kontrolę objawów i odpowiedź na leczenie.

Badania:

Badanie czynności płuc będzie obejmować spirometrię, oscylometrię impulsową (IOS), pomiar szczytowego przepływu wydechowego (PEFR). Zmierzona zostanie również zawartość wydychanego tlenku azotu (FeNO), uznanego biomarkera mierzonego rutynowo w klinikach zajmujących się astmą.

Bio-próbki:

Próbki tła zostaną pobrane ze sprzętu do pobierania próbek i przechowywania w celu zbadania pod kątem skażenia środowiska, w tym sterylnej soli fizjologicznej, wymazu z nosogardzieli, pojemnika na płukanie jamy ustnej/plwociny i bronchoskopu.

Badania krwi zostaną pobrane poprzez upuszczanie krwi i podanie pojedynczej igły. Całkowita objętość pobranej krwi będzie minimalnie dopuszczalną objętością stosowaną u pacjentów pediatrycznych do celów badawczych. Maksymalna całkowita objętość próbki wynosi 50 ml/10 łyżeczek.

Próbki z jamy ustnej będą pobierane przy użyciu standardowej procedury zgodnie z Podręcznikiem procedur dla projektu Human Microbiome. Uczestnicy badania przepłukują usta (płucząc/płucząc) 15 ml sterylnej normalnej soli fizjologicznej przez 1 minutę i wypluwają zawartość jamy ustnej do 50 ml probówki wirówkowej. Próbkę należy przechowywać na lodzie do czasu przetworzenia.

Pobiera się wymaz z nosogardzieli, który umieszcza się w każdym nozdrzu na kilka sekund.

W razie potrzeby u wybranych pacjentów indukowana plwocina zostanie pobrana przy użyciu hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej.

EBC będzie zbierany za pomocą RTube, wyposażonej w jednokierunkowy zawór oddechowy, który umożliwia pobieranie wolne od zanieczyszczeń 200 mikrolitrów na minutę u dorosłych podczas normalnego oddychania.

Stołek zostanie zebrany w zamykanym pojemniku i przechowywany w temperaturze -80°C w celu dalszego przetwarzania.

Bronchoskopia zostanie przeprowadzona w umiarkowanej sedacji w znieczuleniu miejscowym. Mała kamera jest przepuszczana przez struny głosowe do górnych, a następnie dolnych dróg oddechowych. W przypadku płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) do płata płucnego zostanie wkroplone łącznie 60 ml roztworu soli fizjologicznej, a pozostałość zostanie pobrana do analizy. Szczotkowanie śródbłonka (EB) polega na wprowadzeniu przez bronchoskop małej szczoteczki w celu delikatnego oczyszczenia ścian dróg oddechowych w celu pobrania komórek nabłonkowych do analizy w celu badań morfologicznych i funkcjonalnych.

PRZYKŁADOWE PRZETWARZANIE:

Próbki będą przetwarzane i przechowywane w RCSI. Po zebraniu dostępne próbki zostaną przesłane do szpitali uniwersyteckich w Nowym Jorku (dla naszego współpracownika, dr Leopoldo Segala), w celu przetworzenia w celu profilowania mikrobiomu i transkryptomu gospodarza.

Próbki krwi zostaną poddane badaniu pod kątem pełnej morfologii krwi, immunoglobuliny E i wrażliwości na alergeny wziewne. Ponadto krew będzie przetwarzana w celu profilowania odporności gospodarza.

Kontrola tła, płukanie jamy ustnej, wymaz z nosogardzieli, EBC, indukowana plwocina i próbki kału zostaną poddane badaniu pod kątem mikrobiomu. EBC i indukowana plwocina będą również przetwarzane w celu profilowania odporności gospodarza.

Z kohorty bronchoskopowej wszystkie pobrane próbki zostaną poddane analizie mikrobiomu. Przeprowadzimy również profilowanie odporności gospodarza na próbkach BAL. Szczotki wewnątrzoskrzelowe zostaną poddane analizie transkryptomu gospodarza.

• Profilowanie odporności gospodarza: Analiza cytokin próbek zostanie przeprowadzona za pomocą multipleksu Luminex
• Sekwencjonowanie genu 16S rRNA (mikrobiom): Przeprowadzona zostanie ekstrakcja kwasu nukleinowego, amplifikacja i oczyszczanie genu 16S rRNA, a sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone na platformie MiSeq (Illumina). Dane te zostaną przeanalizowane w ramach Quantitative Into Microbial Ecology (QIIME).
• Masowy RNAseq (transciptom gospodarza): RNAseq zostanie przeprowadzony na komórkach nabłonka oskrzeli uzyskanych poprzez szczotkowanie oskrzeli (EB) przy użyciu platformy Hi-seq /Illumina. Sekwencje zostaną dopasowane do genomu referencyjnego zespołu hg19, późniejsze zliczenie genów zostanie przeprowadzone przy użyciu funkcji FeatureCounts, a zróżnicowana ekspresja genów zostanie obliczona przy użyciu pakietu DESeq2 z skorygowaną wartością p <0,05. Analiza ścieżki pomysłowości (IPA) zostanie wykorzystana do identyfikacji najważniejszych funkcji biologicznych. Geny zostaną zmapowane na identyfikatory Ensembl, a następnie na szlaki KEGG. Zastosujemy również podejścia analityczne mające na celu ustalenie profilowania immunologicznego, takie jak CIBERSORT.