CYP2D6 polymorfism hos patienter i allmänmedicin i Österrike

Studera befolkning:

Ej utvalda på varandra följande patienter på kliniken som besöker operationen för en rutinmässig blodprovstagning på grund av olika medicinska tillstånd och som har ordinerats eller har ordinerats läkemedel som metaboliseras av CYP2D6-enzymet (eller läkemedel som är en stark hämmare av CYP 2D6) under de senaste 3 åren . Endast hos dessa patienter bestäms CYP2D6-polymorfism med en bråkdel av EDTA-blodprovet. Inga ytterligare genetiska undersökningar eller ytterligare blodinsamlingar görs.

Patienter som anses vara berättigade att delta i studien måste underteckna ett informerat samtycke efter att ha informerats om syftet med studien.

Blodprovtagning och bearbetning av proverna:

En standardiserad blodprovstagning med ett Vacutainer-system med fyllning av ett EDTA-rör (4 ml) för det röda och vita blodvärdet utförs. 300 mikroliter av det uppsamlade blodet används för ytterligare bestämning av CYP2D6-polymorfismen.

Isolering av DNA:

DNA extraheras från EDTA-blod i praktiklaboratoriet med hjälp av Spin Micro Extraction Kit® (ViennaLab, Wien). Koncentrationen och kvaliteten på DNA mäts med hjälp av en Bio Photometer plus (Eppendorf). Det extraherade DNA:t lagras vid -81°C i en djupfrys med ultralåg temperatur (U101-86, New Brunswick Scientific Co., Inc.) utan några ytterligare tillsatser.

Realtids-PCR för bestämning av kopienummer av CYP2D6-genen:

För bestämning av kopietalet för CYP2D6-genen utförs en realtids-PCR i triplikat på en ABI StepOnePlus med hjälp av CYP2D6 RealFast™ CNV-analysen (ViennaLab) i praktiklaboratoriet.

Testet är baserat på den fluorogena 5'-nukleasanalysen, även känd som TaqMan®-analysen. Varje reaktion innehåller genspecifika primerpar för amplifiering av CYP2D6 och endogena kontrollgenfragment (EC) med 141 bp vardera. Ytterligare komponenter är två dubbelmärkta, genspecifika hydrolysprober, den FAM-märkta CYP2D6-proben och den HEX-märkta EC-proben, som hybridiserar till en intern sekvens av de amplifierade fragmenten. Närheten till 5'-fluorescerande reportern och 3'-quencher-färgämnet på intakta prober förhindrar reportern från att fluorescera. Under förlängningsfasen av PCR klyver 5'-3' exonukleasaktiviteten av Taq DNA-polymeras den 5'-fluorescerande reportern från den hybridiserade sonden. Den fysiska separationen av fluoroforen från quencherfärgämnet genererar en fluorescerande signal i realtid, som är proportionell mot den ackumulerade PCR-produkten. CYP2D6 RealFast™ CNV-analysen är en relativ kvantifieringsanalys och jämför mängden av båda nukleinsyramålen (CYP2D6 och EC) i förhållande till CYP2D6 CNV-kalibratorn. EC-genen används för att normalisera fluorescenssignaler mellan olika prover och fungerar som en PCR-positiv kontroll.

För ytterligare normalisering av data tillsätts ROX-färgämne till en slutlig koncentration av 1 mikroliter till 2 x Probe Mix.

RT-PCR-cykelförhållanden för ABI StepOneplus-cyklern: Initial denaturering: 95°C 10 min 1 cykel; denaturering 95°C 15 sek 40 cykler; glödgning/förlängning 60°C 1 min.

PCR och hybridisering för CYP2D6-allelbestämning med PGX-CYP2D StripAssay™:

Denna analys används för en undergrupp av prover i denna studie och täcker endast 3 polymorfa loci: 1795delT (2D6*6), 1934G>A (2D6*4) och 2637delA (2D6*3). Testprincipen och proceduren liknar PGX-CYP2D6 XL StripAssay® enligt beskrivningen nedan men använder olika cykelförhållanden för Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 94°C/2 min; termocykling: 94°C/15 sek.- 58°C/30 sek.-72°C/30 sek (35 cykler); slutlig förlängning: 72°C/3 min.

PCR och hybridisering för CYP2D6-allelbestämning med PGX-CYP2D6 XL StripAssay®:

För bestämning av 19 kliniskt relevanta CYP2D6-alleler (*1; *2 A, *2 B-M; *3, *4A-H, K, L eller P, *4J eller N, *4M; *5; *6 A, B eller D, *6C; *7, *8; *9,; *10A eller B, *10 C eller D; *11; *12; *14; *15; *17; *29; *35; * 39; *40 eller *58; *41) en PCR-amplifiering på en Palm-Cycler (Corbett Life Science, Eight Mile Plains, QLD 4113, Australien) med användning av biotinylerade primers utförs först. Amplifieringsprodukterna hybridiseras vidare till en testremsa innehållande allelspecifika oligonukleotidsonder immobiliserade som en uppsättning parallella linjer. Bundna biotinylerade sekvenser detekteras med användning av streptavidin-alkaliskt fosfatas och färgsubstrat. Utvärderingen av denna reaktion görs manuellt med hjälp av StripAssay®-Evaluator (ViennaLab, Wien), ett patentskyddat PC-program för att fastställa den homozygota eller heterozygota genotypen.

Cykelförhållanden för Palm-Cycler (Corbett Life Science): pre-PCR: 95°C/4 min; termocykling: 95°C/25 sek.- 60°C/45 sek.-72°C/1 min (36 cykler); slutlig förlängning: 72°C/3 min.

Statistik:

Data registrerades och analyserades med hjälp av Microsoft Excel version 10 och R Language and Environment for Statistical Computing and Graphics, version 2.9. Standardmetoder används för beskrivning av data (frekvenser och procentsatser för kategoridata, medelvärde och standardavvikelse för kontinuerliga data). För att jämföra frekvensen av CYP2D6-specifika läkemedel som ordinerats i den enskilda praktiken med det totala antalet respektive recept i Niederösterreich, beräknas Spearmans rangkorrelationskoefficient. Skillnader mellan grupperna beräknades genom parat t-test. Ett p-värde < 0,05 ansågs indikera statistisk signifikans.

Hardy-Weinberg-jämvikten beräknades med Fishers Exact Chi-Square-test på grund av det lilla antalet genotyper.