D-vitamintillskott och manlig infertilitet: CBG-studien en randomiserad klinisk prövning

Bakgrund År 2008 föddes cirka 8 % av alla nyfödda barn genom assisterad befruktning. Intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) står för ~50 % av alla behandlingar och används främst i fall av kraftigt nedsatt spermakvalitet. Detta är i många fall troligen orsakat av prenatala faktorer som negativt påverkar de utvecklande testiklarna, och det är därför osannolikt att någon behandling av vuxna män helt kommer att kunna normalisera deras spermakvalitet. Men mindre skulle också vara kliniskt relevant. Om minskad spermakvalitet kunde förbättras före eventuell assisterad reproduktion skulle en mindre invasiv behandling behövas. T.ex. klassisk in vitro fertilisering (IVF) snarare än ICSI, enkel intrauterin insemination (IUI) snarare än IVF eller naturlig befruktning snarare än IUI.

Flera endokrina faktorer har varit inblandade i spermieproduktion och mognad, men lite är känt om den potentiella rollen av VD. VD är en nyckelregulator för kalciumhomeostas och benmineralisering, även om uttryck av vitamin D-receptorn (VDR) i olika vävnader har relaterats till flera olika handlingar. VD påverkar reproduktionen hos flera djurarter, övertygande visat hos gnagare, där VD-brist hos hanråttor resulterade i minskat antal spermier, och honråttor inseminerade med sperma från hanråttor med VD-brist hade lägre fertilitetsgrader. Den försämrade reproduktionsförmågan är reversibel och kan korrigeras antingen genom att tillföra VD eller genom att normalisera kalciumnivåerna. Stöds av VDR knockout-möss, som visade minskat spermieantal, minskad spermiemotilitet och histologiska avvikelser i testiklarna, som till skillnad från VD-bristande hanråttor endast delvis kan återställas med kalciumtillskott.

Utredarna har nyligen visat uttryck av VDR och VD-metaboliserande enzymer i den mänskliga testikeln, ejakulationskanalen och i mogna spermier. Utredarna visade därefter att VD i fysiologiska koncentrationer ökade intracellulärt kalcium i spermier. VD verkar genom ett snabbt icke-genomiskt svar och den VD-inducerade ökningen av kalcium kan vara avgörande för spermatozoerna, eftersom VD inducerade spermiemotilitet och akrosomreaktionen. Uttrycksanalys av spermier från fertila och infertila män visade att män med nedsatt spermakvalitet har färre som kan metabolisera VD än normala män (p < 0,0005), vilket gör närvaron av ett av proteinerna till en potentiell markör för spermakvalitet. Dessutom har utredarna just avslutat en tvärsnittsstudie av 300 unga män från den allmänna befolkningen och fann att låg serum-VD var associerad med minskad spermiemotilitet och morfologi.

INSTÄLLNING, VETENSKAPLIG PLAN OCH REKRYTERING Deltagarna kommer att inkluderas bland män som remitteras till avdelningen för tillväxt och reproduktion (avdelningen för GR), Rigshospitalet (RH) för utvärdering av manlig infertilitet

DESIGN Detta är en prospektiv, dubbelblindad, tvåarmad randomiserad kontrollerad studie

Interventionsgrupp: Varje man kommer att få 300 000 IE (7500 ug) kolekalciferol (D3) oralt en gång efter blod- och spermaprov och utförd DXA-skanning. Därefter kommer de att få VD-tabletter på 1 400 IE (35 ug) + 500 mg kalcium dagligen i 3 månader. Telefonkontroll efter 4 veckor och efter 3 månader kommer en klinisk kontroll och blodprovstagning att utföras, följt av fortsatt dagligt intag av 1400 IE VD + 500 mg kalcium under ytterligare 2 månader. Vid slutet av behandlingen fem månader efter inkluderingen levererar männen två spermaprover, tar ett blodprov och gör en DXA-skanning.

Grupp som får placebo: Kommer att följa samma händelsekedja, även om VD kommer att ersättas med placebo.

DELTAGARE Screening av ~700-800 infertila män kommer att utföras. Utredarna antar att ~340 män kommer att uteslutas och ~100 män inte vill delta. Således kommer 300 män att ingå i studien och hälften kommer att randomiseras till aktiv VD-behandling. Utredarna förväntar sig ett litet avhopp (< 20) på grund av hög motivation och inga negativa effekter.

ANALYS OCH INTERVENTION Reproduktiva hormoner och tillväxtfaktorer kommer att analyseras på avd. av GR, Rigshospitalet. En alikvot av det första blodprovet kommer att analyseras innan det inkluderas i studien och ett annat behålls för att analyseras samtidigt som det andra blodprovet i slutet av försöket för att övervinna variationen mellan analysen. Övriga serumanalyser kommer att analyseras vid institutionen för klinisk biokemi, Rigshospitalet. Spermaanalyser och DXA-skanningar kommer att utföras på avd. av GR.

BERÄKNING AV PROVSTORLEK OCH STATISTIK I vår associationsstudie med 300 deltagare kan forskarna upptäcka signifikant dosresponssamband mellan VD-status och spermiers motilitet och morfologi, och fann signifikanta skillnader mellan män med låga och höga VD-nivåer. Baserat på dessa resultat antar utredarna att de kan öka serumnivåerna av VD med 50 nM med vår inställning. Att inkludera 150 män i varje grupp kommer att göra det möjligt för oss att upptäcka förändringar i spermiers motilitet och morfologi på 15 % och en 25 % förändring i Inhibin B-nivåer. Intention to treat-principer kommer att användas och samvarierande analyser kommer att användas för att analysera den potentiella effekten av VD.

BIOSTATISTISK ANALYS Alla analyser kommer att utföras enligt Good Clinical Practice-riktlinjerna och de primära analyserna i intention-to-treat-populationen, som inkluderade alla patienter som genomgick randomisering och fick den första dosen av medicinen dag 1. Vi kommer att analysera data på 3 sätt. Den primära analysen kommer att fortsätta enligt den randomiserade D-vitamin- och kalciumdosgruppstilldelningen. Den sekundära analysen kommer att baseras på att stratifiera männen enligt subgruppsanalyser i förhållande till de fördefinierade primära och sekundära effektmåtten, medan den sista analysen kommer att försöka belysa eventuella dos-responssamband. En författare (JHP) som var statistiker för studien och omedveten om studiegruppsuppgifterna kommer att utföra den primära analysen.

Dataanalys och kvalitet De primära slutpunkterna för detta protokoll kommer att vara förändringar i spermakvalitet, särskilt spermiemotilitet följt av spermiekoncentration, morfologi och spermavolym. Flera sekundära endpoints finns men för den inledande undersökningen kommer fokus att ligga på förändringar av följande sekundära endpoints: Spermier DFI, graviditetsfrekvens, Inhibin B, vitamin D och kalciumhomeostas. Försökspersoner som avslutar deltagandet efter besök vid 90 dagar men före besöksdag 150 kommer att inkluderas för dataanalys fram till dag 90. Män som bara levererar ett spermaprov eller som saknar data vid något besök kommer fortfarande att inkluderas i analysen. Män med feber upp till 3 månader före spermaanalys kommer att betraktas som en potentiell konfounder. Män som inte uppfyller kriterierna i protokollet kommer att exkluderas från analysen. Dessa värden kommer sedan att föras vidare för analyser. En signifikansnivå på 5 % används. För de primära analyserna beräknas Bonferronu-Holm p-värdeskorrektion dessutom. För den sekundära analysen används ingen multipla testkorrigering. Istället diskuteras resultaten med tanke på de många testsituationerna.

1. Analyser mellan placebo kontra aktiv substans Mellan gruppanalyser placebo kontra vitamin D + kalcium: Det första steget kommer att vara att jämföra förändringarna i primära resultat mellan de två grupperna placebo kontra vitamin D + kalcium. Denna analys kommer att visa om det finns en signifikant skillnad mellan grupperna. För utfall som mäts upprepade gånger kommer detta att innebära att man jämför de uppskattade lutningarna, eller förändringshastigheterna, för varje utfall mellan grupperna. Blandade modeller tillåter att korrelationen mellan de upprepade observationerna baslinje-dag 1-dag 90-dag 150 från varje man på lämpligt sätt inkorporeras i parameteruppskattning. För alla effektmått uppmätta vid baslinjen och dag 150 kommer parade t-tester att användas för att bedöma att det finns en signifikant skillnad mellan grupperna och avgöra om medelförändringen inom varje grupp skiljer sig signifikant från noll. I båda fallen kommer data att omvandlas efter behov för att möta modellens antaganden. Efteråt kommer samma analys att genomföras genom att använda multipel regression med relevanta konfounders såsom säsong, BMI, rökning, abstinens varaktighet, tid från utlösning till motilitetsbedömning, feber etc. för att se om detta förändrar resultaten För uppmätta resultat som inte kan jämfört med t-test eller andra parametriska test på dag 1, dag 90 och dag 150, kommer grupper att jämföras med hjälp av icke-parametriska tester såsom Wilcoxon Mann-Whitney test. För binärt utfall kommer data att jämföras mellan de två grupperna med hjälp av villkorad logistisk regressionsanalys med justering för relevanta konfounders (definierad som signifikant p<0,05 associerad).

   .

2. Analyser efter stratifiering i undergrupper Försökspersonerna kommer att grupperas efter deras BMI, kalcium, säsong, spermakvalitet, benfaktorer, BMD eller vitamin D-nivåer och effekten av placebo kontra aktiv substans kommer att utvärderas på dag 90 och dag 150. Undergruppsanalyserna kommer i enlighet med normal klinisk praxis och stratifiering i lämpliga grupper enligt klinisk (25OHD < 25 nmol/l, BMI <25, 25-30, >30 etc.), tertiler/kvartiler/kvintiler eller högsta/lägsta jämfört med att ligga kvar vid baslinjen.
3. Dataanalys för jämförelse av förändringar i vitamin D och kalcium Vi kommer också att jämföra dos-responssambanden mellan förändringar i vitamin D och kalcium och primära och sekundära effektmått mellan placebo och aktiv substansgrupp och hos alla män. Vi kommer att bestämma delta-värden för cirkulerande vitamin D-progenitorer, kalciumjon, totalt kalcium och albuminkorrigerat kalcium från start till 90 dagar och 150 dagar och jämföra skillnaden med de observerade förändringarna i primära och sekundära effektmått. Vi förutser att det inte finns någon skillnad i form av dos-responskurvan mellan de olika ändpunkterna, dvs de kommer att vara parallella och linjära åtminstone efter transformation av data. Efteråt kommer samma analys att genomföras genom att använda relevanta konfounders såsom säsong, BMI, rökning, varaktighet av abstinens, tid från utlösning till motilitetsbedömning etc. för att se om detta förändrar resultaten.

SCREENING OCH TIDSKURS Män, som utreds på avd. av GR på grund av infertilitet kommer att screenas för berättigande till studien, och de som uppfyller kriterierna för deltagande kommer att informeras, och om de samtycker tilldelas aktiv behandling med VD eller placebo. Allokering kommer att göras genom minimering med minim för att undvika obalanserad gruppering på grund av randomiseringsfel. Följande variabler kommer att balanseras: Spermiekoncentration, BMI, seruminhibin-B och VD-nivå.

ETIK OCH BIVERKNINGAR Alla patienter kommer att ha genomfört sin utredning innan de bjuds in till studien. De kommer att informeras om potentiella negativa effekter, tecken på berusning och de kan lämna rättegången när som helst utan några konsekvenser. Försöket kommer att genomföras i enlighet med "god klinisk sed". VD-behandling ger praktiskt taget inga biverkningar och risken för berusning är nästan obefintlig i den föreslagna miljön, med relativt låga doser av VD och noggrann övervakning av VD och kalciumstatus. Deltagarna kommer att exponeras för oral VC/placebo, för 2 DXA-skanningar, få 3 extra blodprover och leverera 2 extra spermaprover. Alla deltagare kommer att informeras och ge råd i enlighet med deras VD-status.

PUBLICERING AV RESULTAT Alla resultat, positiva eller negativa, kommer att skickas till peer reviewed vetenskapliga tidskrifter. Data kommer successivt att erhållas och överföras till en statistisk databas.

PRAKTISKA FRÅGOR Avdelningen för GR utreder årligen mer än 500 infertila män. Deltagare kommer att inkluderas från den gruppen. Avdelningen har den kliniska kompetensen, erfarenheten och kapaciteten att utföra alla undersökningar, förutom mätningarna av några av blodproverna, som kommer att analyseras av institutionen för klinisk biokemi. VD och placebo orala suspensioner köps från Glostrup apotek, medan VD och placebotabletter köps från Ferrosan, MD Martin. Utredarna samarbetar med docent i biostatistik J.H. Petersen, Köpenhamns universitet.