D-vitamintilskud og mandlig infertilitet: CBG-undersøgelsen et randomiseret klinisk forsøg

Baggrund I 2008 blev cirka 8 % af alle nyfødte børn undfanget ved assisteret befrugtning. Intracytoplasmatisk sædinjektion (ICSI) udgør ~50% af alle behandlinger og anvendes hovedsageligt i tilfælde af alvorligt nedsat sædkvalitet. Dette er i mange tilfælde højst sandsynligt forårsaget af prænatale faktorer, der påvirker de udviklende testikler negativt, og det er derfor usandsynligt, at nogen behandling af voksne mænd vil være i stand til fuldstændig at normalisere deres sædkvalitet. Mindre ville dog også være klinisk relevant. Hvis nedsat sædkvalitet kunne forbedres før enhver assisteret reproduktion, ville en mindre invasiv behandling være nødvendig. F.eks. klassisk in vitro fertilisering (IVF) frem for ICSI, simpel intrauterin insemination (IUI) frem for IVF eller naturlig undfangelse frem for IUI.

Adskillige endokrine faktorer har været impliceret i sædproduktion og -modning, men lidt er kendt om den potentielle rolle af VD. VD er en nøgleregulator for calciumhomeostase og knoglemineralisering, selvom ekspression af vitamin D-receptoren (VDR) i forskellige væv har været relateret til flere forskellige handlinger. VD påvirker reproduktionen hos flere dyrearter, overbevisende vist hos gnavere, hvor VD-mangel hos hanrotter resulterede i reduceret sædtal, og hunrotter insemineret med sæd fra VD-mangelfulde hanrotter havde lavere fertilitetsrater. Den nedsatte reproduktionsevne er reversibel og kan korrigeres enten ved at tilføre VD eller ved at normalisere calciumniveauer. Understøttet af VDR knockout-mus, som viste nedsatte sædceller, nedsat sædmotilitet og histologiske abnormiteter i testiklen, som i modsætning til de VD-mangelfulde hanrotter kun delvist kan genoprettes med calciumtilskud.

Efterforskerne har for nylig vist ekspression af VDR og de VD-metaboliserende enzymer i den humane testikel, ejakulationskanalen og i modne spermatozoer. Efterforskerne viste efterfølgende, at VD i fysiologiske koncentrationer øgede intracellulært calcium i spermatozoer. VD virker gennem en hurtig ikke-genomisk respons, og den VD-inducerede stigning i calcium kan være afgørende for spermatozoerne, fordi VD inducerede sædmotilitet og akrosomreaktionen. Ekspressionsanalyse af spermatozoer fra fertile og infertile mænd viste, at mænd med nedsat sædkvalitet har færre, der kan metabolisere VD end normale mænd (p < 0,0005), hvilket gør tilstedeværelsen af ​​et af proteinerne til en potentiel markør for sædkvalitet. Desuden har efterforskerne netop afsluttet en tværsnitsundersøgelse af 300 unge mænd fra den generelle befolkning og fundet, at lav serum VD var forbundet med nedsat sædmotilitet og morfologi.

INDSTILLINGER, VIDENSKABLIG PLAN OG REKRUTTERING Deltagerne vil blive inkluderet blandt mænd, der henvises til Afdeling for Vækst og Reproduktion (GR), Rigshospitalet (RH) for evaluering af mandlig infertilitet

DESIGN Dette er et prospektivt, dobbeltblindet, to-armet randomiseret kontrolleret forsøg

Interventionsgruppe: Hver mand vil modtage 300.000 IE (7500 ug) cholecalciferol (D3) oralt én gang efter blod- og sædprøvetagning og udført DXA-scanning. Derefter vil de modtage VD-tabletter på 1.400 IE (35 ug) + 500 mg calcium dagligt i 3 måneder. Telefonkontrol efter 4 uger og efter 3 måneder udføres en klinisk kontrol og blodprøvetagning, efterfulgt af fortsat daglig indtagelse af 1400 IE VD + 500 mg calcium i yderligere 2 måneder. Ved afslutning af behandlingen fem måneder efter inklusion afleverer mændene to sædprøver, får udtaget en blodprøve og foretaget en DXA-scanning.

Gruppe, der modtager placebo: Følger den samme kæde af hændelser, selvom VD vil blive erstattet med placebo.

DELTAGERE Der vil blive udført screening af ~700-800 infertile mænd. Efterforskerne antager, at ~340 mænd vil blive udelukket, og ~100 mænd ikke ønsker at deltage. Således vil 300 mænd indgå i undersøgelsen, og halvdelen vil blive randomiseret til aktiv VD-behandling. Efterforskerne forventer et lille frafald (< 20) på grund af høj motivation og ingen bivirkninger.

ANALYSE OG INTERVENTION Reproduktive hormoner og vækstfaktorer vil blive analyseret på afd. af GR, Rigshospitalet. En alikvot af den første blodprøve vil blive analyseret før inklusion i undersøgelsen, og en anden opbevares for at blive analyseret på samme tid som den anden blodprøve ved afslutningen af ​​forsøget for at overvinde interassay-variationen. Øvrige serumanalyser vil blive analyseret på Klinisk Biokemisk Afdeling, Rigshospitalet. Sædanalyser og DXA-scanninger vil blive udført på afd. af GR.

BEREGNING AF PRØVESTØRRELSE OG STATISTIK I vores associeringsstudie med 300 deltagere er efterforskerne i stand til at påvise signifikant dosisresponsforhold mellem VD-status og sædmotilitet og morfologi, og fandt signifikante forskelle mellem mænd med lave og høje VD-niveauer. Baseret på disse resultater antager efterforskerne at være i stand til at øge serumniveauer af VD med 50 nM med vores opsætning. At inkludere 150 mænd i hver gruppe vil gøre os i stand til at påvise ændringer i sædmotilitet og morfologi på 15 % og en ændring på 25 % i Inhibin B-niveauer. Intention to treat principper vil blive brugt, og co-variate analyser vil blive brugt til at analysere den potentielle effekt af VD.

BIOSTATISTISK ANALYSE Alle analyserne vil blive udført i henhold til retningslinjerne for god klinisk praksis og de primære analyser i intention-to-treat-populationen, som omfattede alle patienter, der har gennemgået randomisering og modtog den første dosis medicin på dag 1. Vi analyserer dataene på 3 måder. Den primære analyse vil fortsætte i henhold til den randomiserede D-vitamin- og calciumdosisgruppetildeling. Den sekundære analyse vil være baseret på at stratificere mændene efter undergruppeanalyser i forhold til de foruddefinerede primære og sekundære endepunkter, mens den sidste analyse vil forsøge at belyse en eventuel dosis-respons sammenhæng. En forfatter (JHP), der var statistiker for undersøgelsen og uvidende om undersøgelsesgruppeopgaverne, vil udføre den primære analyse.

Dataanalyse og kvalitet De primære endepunkter for denne protokol vil være ændringer i sædkvalitet, især sædmotilitet efterfulgt af sædkoncentration, morfologi og sædvolumen. Der findes flere sekundære endepunkter, men for den indledende undersøgelse vil fokus være på ændringer af følgende sekundære endepunkter: Sperm DFI, graviditetsrate, Inhibin B, D-vitamin og calciumhomeostase. Forsøgspersoner, der afslutter deltagelsen efter besøg efter 90 dage, men før besøgsdag 150, vil blive inkluderet til dataanalyse op til dag 90. Mænd, der kun afgiver én sædprøve eller mangler data ved ethvert besøg, vil stadig blive inkluderet i analysen. Mænd med feber op til 3 måneder før sædanalyse vil blive betragtet som en potentiel konfounder. Mænd, der ikke opfylder kriterierne i protokollen, vil blive udelukket fra analysen. Disse værdier vil derefter blive videreført til analyser. Der anvendes et signifikansniveau på 5 %. Til de primære analyser beregnes Bonferronu-Holm p-værdi korrektion yderligere. Til den sekundære analyse anvendes ingen multiple testkorrektion. I stedet diskuteres resultaterne i lyset af de mange testsituationer.

1. Analyser mellem placebo versus aktivt stof Mellem gruppeanalyser placebo versus D-vitamin + calcium: Det første skridt vil være at sammenligne ændringerne i primære resultater på tværs af de to grupper placebo versus D-vitamin + calcium. Denne analyse vil vise, om der er en signifikant forskel mellem grupperne. For udfald målt gentagne gange vil dette indebære sammenligning af de estimerede hældninger eller ændringsrater for hvert udfald mellem grupperne. Blandede modeller giver mulighed for, at korrelationen mellem de gentagne observationer baseline-dag 1-dag 90-dag 150 fra hver mand kan inkorporeres passende i parameterestimering. For alle endepunkter målt ved baseline og dag 150, vil parrede t-tests blive brugt til at vurdere, om der er en signifikant forskel mellem grupperne og bestemme, om den gennemsnitlige ændring inden for hver gruppe adskiller sig signifikant fra nul. I begge tilfælde vil data blive transformeret efter behov for at opfylde modellens antagelser. Efterfølgende vil den samme analyse blive udført ved at bruge multipel regression med relevante konfoundere såsom sæson, BMI, rygning, varighed af abstinens, tid fra ejakulation til motilitetsvurdering, feber etc. for at se, om dette ændrer resultaterne For målte resultater, der ikke kan sammenlignet med t-test eller andre parametriske test på dag 1, dag 90 og dag 150, vil grupper blive sammenlignet ved hjælp af ikke-parametriske test, såsom Wilcoxon Mann-Whitney test. For binært udfald vil dataene blive sammenlignet mellem de to grupper ved hjælp af betinget logistisk-regressionsanalyse med justering for relevante konfoundere (defineret som værende signifikant p<0,05 associeret).

   .

2. Analyser efter stratificering i undergrupper Forsøgspersoner vil blive grupperet efter deres BMI, calcium, sæson, sædkvalitet, knoglefaktorer, BMD eller D-vitamin niveauer, og effekten af ​​placebo versus aktivt stof vil blive evalueret på dag 90 og dag 150. Undergruppeanalyserne vil i overensstemmelse med normal klinisk praksis og stratificering i passende grupper efter de kliniske (25OHD < 25 nmol/l, BMI <25, 25-30, >30 osv.), tertiler/kvartiler/kvintiler eller højeste/laveste versus at forblive ved baseline.
3. Dataanalyse til sammenligning af ændringer i D-vitamin og calcium Vi vil også sammenligne dosis-respons sammenhænge mellem ændringer i D-vitamin og calcium og primære og sekundære endepunkter mellem placebo og aktivstofgruppe og hos alle mænd. Vi vil bestemme delta-værdier for cirkulerende vitamin D-progenitorer, calciumion, total calcium og albuminkorrigeret calcium fra start til 90 dage og 150 dage og sammenligne forskellen med de observerede ændringer i primære og sekundære endepunkter. Vi forventer, at der ikke er nogen forskel i formerne af dosis-respons-kurven mellem de forskellige endepunkter, dvs. de vil være parallelle og lineære i det mindste efter transformation af dataene. Bagefter vil den samme analyse blive udført ved at bruge relevante konfoundere som sæson, BMI, rygning, varighed af abstinens, tid fra ejakulation til motilitetsvurdering etc. for at se, om dette ændrer resultaterne.

SCREENING OG TIDSKURS Mænd, som udredes på afd. af GR på grund af infertilitet vil blive screenet for berettigelse til undersøgelsen, og de, der opfylder kriterierne for deltagelse, vil blive informeret, og hvis de samtykker tildelt aktiv behandling med VD eller placebo. Tildeling vil ske ved minimering ved hjælp af minim for at undgå ubalanceret gruppering på grund af randomiseringsfejl. Følgende variabler vil blive afbalanceret: Spermkoncentration, BMI, serum inhibin-B og VD niveau.

ETIK OG BIVIRKNINGER Alle patienter vil have gennemført deres undersøgelse, før de inviteres til undersøgelsen. De vil blive informeret om potentielle bivirkninger, tegn på forgiftning, og de kan forlade retssagen til enhver tid uden konsekvenser. Forsøget vil køre i overensstemmelse med "god klinisk praksis". VD-behandling giver stort set ingen bivirkninger, og risikoen for forgiftning er næsten ikke-eksisterende i den foreslåede indstilling, med relativt lave doser af VD og tæt overvågning af VD og calciumstatus. Deltagerne vil blive udsat for oral VC/placebo, for 2 DXA-scanninger, få udtaget 3 ekstra blodprøver og levere 2 ekstra sædprøver. Alle deltagere vil blive informeret og rådgivet i henhold til deres VD-status.

OFFENTLIGGØRELSE AF RESULTATER Alle resultater, positive eller negative, vil blive indsendt til peer reviewed videnskabelige tidsskrifter. Data vil successivt blive indhentet og overført til en statistisk database.

PRAKTISKE SPØRGSMÅL GR-afdelingen undersøger årligt mere end 500 infertile mænd. Deltagere vil blive inkluderet fra den gruppe. Afdelingen har den kliniske ekspertise, erfaring og kapacitet til at udføre alle undersøgelser, bortset fra målingerne af nogle af blodprøverne, som vil blive analyseret af afdelingen for klinisk biokemi. VD og placebo oral suspension købes hos Glostrup apotek, mens VD og placebo tabletter købes hos Ferrosan, MD Martin. Efterforskerne samarbejder med lektor i biostatistik J.H. Petersen, Københavns Universitet.