Vitamine D-suppletie en mannelijke onvruchtbaarheid: de CBG-studie een gerandomiseerde klinische studie

Achtergrond In 2008 werd ongeveer 8% van alle pasgeboren kinderen verwekt door middel van kunstmatige voortplanting. Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) is goed voor ~ 50% van alle behandelingen en wordt voornamelijk gebruikt in gevallen van ernstig verminderde spermakwaliteit. Dit wordt in veel gevallen hoogstwaarschijnlijk veroorzaakt door prenatale factoren die de zich ontwikkelende testikels nadelig beïnvloeden, en het is daarom onwaarschijnlijk dat enige behandeling van volwassen mannen hun spermakwaliteit volledig zal kunnen normaliseren. Minder zou echter ook klinisch relevant zijn. Als de verminderde spermakwaliteit zou kunnen worden verbeterd voorafgaand aan enige geassisteerde voortplanting, zou een minder ingrijpende behandeling nodig zijn. Bijv. klassieke in-vitrofertilisatie (IVF) in plaats van ICSI, eenvoudige intra-uteriene inseminatie (IUI) in plaats van IVF of natuurlijke bevruchting in plaats van IUI.

Verschillende endocriene factoren zijn betrokken bij de productie en rijping van sperma, maar er is weinig bekend over de mogelijke rol van VD. VD is een belangrijke regulator van calciumhomeostase en botmineralisatie, hoewel expressie van de vitamine D-receptor (VDR) in verschillende weefsels in verband is gebracht met verschillende verschillende acties. VD beïnvloedt de voortplanting bij verschillende diersoorten, overtuigend aangetoond bij knaagdieren, waar VD-deficiëntie bij mannelijke ratten resulteerde in een verminderd aantal zaadcellen, en vrouwelijke ratten geïnsemineerd met sperma van VD-deficiënte mannelijke ratten hadden lagere vruchtbaarheidscijfers. De verminderde voortplantingsfunctie is omkeerbaar en kan worden gecorrigeerd door VD toe te dienen of door de calciumspiegels te normaliseren. Ondersteund door VDR-knockout-muizen, die een verminderd aantal zaadcellen, verminderde spermamotiliteit en histologische afwijkingen van de testis vertoonden, die in tegenstelling tot de VD-deficiënte mannelijke ratten slechts gedeeltelijk kunnen worden hersteld door calciumsupplementen.

De onderzoekers hebben onlangs expressie van VDR en de VD-metaboliserende enzymen aangetoond in de menselijke testis, het ejaculatiekanaal en in volwassen spermatozoa. De onderzoekers toonden vervolgens aan dat VD in fysiologische concentraties het intracellulaire calcium in spermatozoa verhoogde. VD werkt via een snelle niet-genomische respons en de door VD geïnduceerde toename van calcium kan cruciaal zijn voor de spermatozoa, omdat VD de beweeglijkheid van het sperma en de acrosoomreactie induceerde. Expressie-analyse van spermatozoa van vruchtbare en onvruchtbare mannen toonde aan dat mannen met verminderde spermakwaliteit er minder hebben die VD kunnen metaboliseren dan normale mannen (p <0,0005), waardoor de aanwezigheid van een van de eiwitten een potentiële marker van spermakwaliteit is. Bovendien hebben de onderzoekers zojuist een dwarsdoorsnede-onderzoek van 300 jonge mannen uit de algemene bevolking afgerond en ontdekten ze dat een lage serum-VD geassocieerd was met een verminderde beweeglijkheid en morfologie van het sperma.

SETTING, WETENSCHAPPELIJK PLAN EN REKRUTERING Deelnemers zullen worden opgenomen onder mannen die zijn doorverwezen naar het Department of Growth and Reproduction (afdeling GR), Rigshospitalet (RH) voor evaluatie van mannelijke onvruchtbaarheid

ONTWERP Dit is een prospectieve, dubbelblinde, gerandomiseerde, gecontroleerde studie met twee armen

Interventiegroep: Elke man krijgt eenmaal oraal 300.000 IE (7500 ug) cholecalciferol (D3) na bloed- en spermaafname en uitgevoerde DXA-scan. Daarna krijgen ze dagelijks VD-tabletten van 1.400 IE (35 µg) + 500 mg calcium gedurende 3 maanden. Telefonische controle na 4 weken en na 3 maanden zal een klinische controle en bloedafname worden uitgevoerd, gevolgd door een voortgezette dagelijkse inname van 1400 IE VD + 500 mg calcium gedurende 2 extra maanden. Aan het eind van de behandeling, vijf maanden na opname, leveren de mannen twee spermamonsters af, laten ze bloed prikken en een DXA-scan maken.

Groep die placebo krijgt: volgt dezelfde keten van gebeurtenissen, hoewel VD zal worden vervangen door placebo.

DEELNEMERS Screening van ~700-800 onvruchtbare mannen zal worden uitgevoerd. De onderzoekers gaan ervan uit dat ~340 mannen worden uitgesloten en ~100 mannen niet willen deelnemen. Er zullen dus 300 mannen in de studie worden opgenomen en de helft zal worden gerandomiseerd naar actieve VD-behandeling. De onderzoekers verwachten een kleine uitval (< 20) vanwege hoge motivatie en geen nadelige effecten.

ANALYSE EN INTERVENTIE Reproductieve hormonen en groeifactoren worden geanalyseerd op dept. van GR, Rigshospitalet. Een aliquot van het eerste bloedmonster zal worden geanalyseerd voordat het in het onderzoek wordt opgenomen en een ander deel wordt bewaard om tegelijkertijd met het tweede bloedmonster aan het einde van de proef te worden geanalyseerd om de interassay-variatie te overwinnen. Andere serumanalyses zullen worden geanalyseerd op de afdeling klinische biochemie, Rigshospitalet. Sperma-analyses en DXA-scans worden uitgevoerd op dept. van GR.

STEEKPROEFGROOTTEBEREKENING EN STATISTIEKEN In onze associatiestudie met 300 deelnemers zijn de onderzoekers in staat om een ​​significante dosis-responsrelatie tussen de VD-status en de beweeglijkheid en morfologie van het sperma te detecteren, en vonden ze significante verschillen tussen mannen met lage en hoge VD-niveaus. Op basis van deze resultaten gaan de onderzoekers ervan uit dat ze met onze opstelling de serumspiegels van VD met 50 nM kunnen verhogen. Door 150 mannen in elke groep op te nemen, kunnen we veranderingen in de beweeglijkheid en morfologie van het sperma van 15% en een verandering van 25% in de niveaus van Inhibine B detecteren. Intentie om te behandelen principes zullen worden gebruikt en co-variabele analyses zullen worden gebruikt om het potentiële effect van VD te analyseren.

BIOSTATISTISCHE ANALYSE Alle analyses zullen worden uitgevoerd volgens de Good Clinical Practice-richtlijnen en de primaire analyses in de intention-to-treat-populatie, die alle patiënten omvatte die randomisatie ondergingen en de eerste dosis geneesmiddel kregen op dag 1. We gaan de data op 3 manieren analyseren. De primaire analyse zal verlopen volgens de gerandomiseerde vitamine D- en calciumdosisgroepstoewijzing. De secundaire analyse zal gebaseerd zijn op het stratificeren van de mannen volgens subgroepanalyses met betrekking tot de vooraf gedefinieerde primaire en secundaire eindpunten, terwijl de laatste analyse zal proberen om eventuele dosis-responsrelaties op te helderen. Een auteur (JHP) die de statisticus was voor het onderzoek en niet op de hoogte was van de opdrachten van de studiegroepen, zal de primaire analyse uitvoeren.

Gegevensanalyse en kwaliteit De primaire eindpunten voor dit protocol zijn veranderingen in de spermakwaliteit, met name de spermamotiliteit, gevolgd door de spermaconcentratie, morfologie en spermavolume. Er zijn meerdere secundaire eindpunten, maar voor het eerste onderzoek zal de nadruk liggen op veranderingen van de volgende secundaire eindpunten: DFI van het sperma, zwangerschapspercentage, inhibine B, vitamine D en calciumhomeostase. Proefpersonen die deelname beëindigen na bezoek op 90 dagen maar vóór bezoek op dag 150, worden opgenomen voor data-analyse tot dag 90. Mannen die slechts één spermamonster afleveren of bij een bezoek gegevens missen, worden toch in de analyse opgenomen. Mannen met koorts tot 3 maanden voorafgaand aan de sperma-analyse zullen als een mogelijke confounder worden beschouwd. Mannen die niet voldoen aan de criteria in het protocol worden uitgesloten van de analyse. Die waarden worden vervolgens overgedragen voor analyses. Er wordt een significantieniveau van 5% gehanteerd. Voor de primaire analyses wordt bovendien Bonferronu-Holm p-waardecorrectie berekend. Voor de secundaire analyse wordt geen meervoudige testcorrectie gebruikt. In plaats daarvan worden de resultaten besproken met het oog op de verschillende testsituaties.

1. Analyses tussen placebo versus werkzame stof Tussengroepsanalyses placebo versus vitamine D + calcium: De eerste stap is het vergelijken van de veranderingen in primaire uitkomsten tussen de twee groepen placebo versus vitamine D + calcium. Deze analyse laat zien of er een significant verschil is tussen de groepen. Voor uitkomsten die herhaaldelijk worden gemeten, houdt dit in dat de geschatte hellingen, of veranderingspercentages, van elke uitkomst tussen de groepen worden vergeleken. Gemengde modellen zorgen ervoor dat de correlatie tussen de herhaalde waarnemingen basislijn-dag 1-dag 90-dag 150 van elke man op geschikte wijze kan worden opgenomen in parameterschatting. Voor alle eindpunten gemeten bij baseline en dag 150, zullen gepaarde t-testen worden gebruikt om te beoordelen of er een significant verschil is tussen de groepen en om te bepalen of de gemiddelde verandering binnen elke groep significant verschilt van nul. In beide gevallen worden gegevens zo nodig getransformeerd om aan de modelaannames te voldoen. Daarna wordt dezelfde analyse uitgevoerd door gebruik te maken van meervoudige regressie met relevante confounders zoals seizoen, BMI, roken, duur van onthouding, tijd van ejaculatie tot motiliteitsbeoordeling, koorts enz. om te zien of dit de resultaten verandert Voor gemeten resultaten die niet kunnen worden bepaald vergeleken met t-test of andere parametrische tests op dag 1, dag 90 en dag 150, zullen groepen worden vergeleken met behulp van niet-parametrische tests zoals de Wilcoxon Mann-Whitney-test. Voor de binaire uitkomst zullen de gegevens tussen de twee groepen worden vergeleken door middel van voorwaardelijke logistische-regressieanalyse met correctie voor relevante confounders (gedefinieerd als zijnde significant geassocieerd met p<0,05).

   .

2. Analyses na stratificatie in subgroepen Proefpersonen zullen worden gegroepeerd op basis van hun BMI, calcium, seizoen, spermakwaliteit, botfactoren, BMD of vitamine D-spiegels en het effect van placebo versus werkzame stof zal worden geëvalueerd op dag 90 en dag 150. De subgroepanalyses zullen in overeenstemming zijn met de normale klinische praktijk en stratificatie in geschikte groepen volgens de klinische (25OHD < 25 nmol/l, BMI <25, 25-30, >30 etc.), tertielen/kwartielen/kwintielen of hoogste/laagste versus op baseline blijven.
3. Gegevensanalyse voor vergelijking van veranderingen in vitamine D en calcium We zullen ook de dosis-responsrelaties tussen veranderingen in vitamine D en calcium en primaire en secundaire eindpunten tussen placebo en werkzame stofgroep en bij alle mannen vergelijken. We zullen deltawaarden bepalen voor circulerende vitamine D-progenitors, calciumionen, totaal calcium en voor albumine gecorrigeerd calcium van start tot 90 dagen en 150 dagen en het verschil vergelijken met de waargenomen veranderingen in primaire en secundaire eindpunten. We verwachten dat er geen verschil is in de vorm van de dosis-responscurve tussen de verschillende eindpunten, d.w.z. ze zullen in ieder geval na transformatie van de gegevens parallel en lineair zijn. Daarna zal dezelfde analyse worden uitgevoerd door gebruik te maken van relevante confounders zoals seizoen, BMI, roken, duur van onthouding, tijd van ejaculatie tot motiliteitsbeoordeling etc. om te zien of dit de resultaten verandert.

SCREENING EN TIJDVERLOOP Mannen, die worden onderzocht op dept. van GR als gevolg van onvruchtbaarheid zal worden gescreend op geschiktheid voor de studie, en degenen die voldoen aan de criteria voor deelname zullen worden geïnformeerd, en als zij ermee instemmen worden ze toegewezen aan actieve behandeling met VD of placebo. Toewijzing vindt plaats door minimalisatie met behulp van minim om onevenwichtige groepering als gevolg van mislukte randomisatie te voorkomen. De volgende variabelen worden afgewogen: spermaconcentratie, BMI, seruminhibine-B en VD-niveau.

ETHIEK EN BIJWERKINGEN Alle patiënten hebben hun onderzoek afgerond voordat ze worden uitgenodigd voor het onderzoek. Ze worden op de hoogte gebracht van mogelijke bijwerkingen, tekenen van intoxicatie en ze kunnen de proef op elk moment zonder gevolgen verlaten. De proef zal verlopen in overeenstemming met "goede klinische praktijk". VD-behandeling geeft vrijwel geen bijwerkingen en het risico op intoxicatie is bijna onbestaande in de voorgestelde setting, met relatief lage doses VD en nauwlettend toezicht op de VD- en calciumstatus. De deelnemers worden blootgesteld aan orale VC/placebo, 2 DXA-scans, 3 extra bloedmonsters en 2 extra spermamonsters. Alle deelnemers worden geïnformeerd en begeleid volgens hun VD-status.

PUBLICATIE VAN RESULTATEN Alle resultaten, positief of negatief, zullen worden voorgelegd aan collegiaal getoetste wetenschappelijke tijdschriften. Achtereenvolgens worden gegevens verkregen en overgebracht naar een statistische database.

PRAKTISCHE KWESTIES Afdeling GR onderzoekt jaarlijks meer dan 500 onvruchtbare mannen. Uit die groep komen deelnemers. De afdeling heeft de klinische expertise, ervaring en capaciteit om alle onderzoeken uit te voeren, met uitzondering van de metingen van enkele bloedmonsters, die door de afdeling klinische biochemie zullen worden geanalyseerd. VD en placebo orale suspensies worden gekocht bij Glostrup apotek, terwijl VD en placebotabletten worden gekocht bij Ferrosan, MD Martin. De onderzoekers werken samen met universitair hoofddocent biostatistiek J.H. Petersen, Universiteit van Kopenhagen.