Suplementacja witaminy D i niepłodność u mężczyzn: badanie CBG w randomizowanym badaniu klinicznym

Kontekst W 2008 r. około 8% wszystkich noworodków zostało poczętych w drodze rozrodu wspomaganego. Intracytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI) stanowi około 50% wszystkich zabiegów i jest stosowane głównie w przypadkach znacznie obniżonej jakości nasienia. W wielu przypadkach jest to najprawdopodobniej spowodowane przez czynniki prenatalne, które niekorzystnie wpływają na rozwijające się jądra, dlatego jest mało prawdopodobne, aby jakakolwiek terapia dorosłych mężczyzn była w stanie całkowicie znormalizować jakość ich nasienia. Jednak mniej byłoby również istotne klinicznie. Gdyby można było poprawić obniżoną jakość nasienia przed jakimkolwiek wspomaganym rozrodem, potrzebne byłoby mniej inwazyjne leczenie. Np. klasyczne zapłodnienie in vitro (IVF) zamiast ICSI, prosta inseminacja domaciczna (IUI) zamiast IVF lub naturalne zapłodnienie zamiast IUI.

W produkcję i dojrzewanie plemników zaangażowanych jest kilka czynników endokrynologicznych, ale niewiele wiadomo na temat potencjalnej roli VD. VD jest kluczowym regulatorem homeostazy wapnia i mineralizacji kości, chociaż ekspresja receptora witaminy D (VDR) w różnych tkankach jest związana z kilkoma różnymi działaniami. VD wpływa na reprodukcję u kilku gatunków zwierząt, co zostało przekonująco wykazane u gryzoni, gdzie niedobór VD u samców szczurów spowodował zmniejszenie liczby plemników, a samice szczurów zapłodnione nasieniem samców szczurów z niedoborem VD miały niższe współczynniki płodności. Upośledzona zdolność rozrodcza jest odwracalna i można ją skorygować poprzez dostarczenie VD lub normalizację poziomu wapnia. Wspierane przez myszy z nokautem VDR, które wykazywały zmniejszoną liczbę plemników, zmniejszoną ruchliwość plemników i nieprawidłowości histologiczne jąder, które w przeciwieństwie do samców szczurów z niedoborem VD tylko częściowo można przywrócić za pomocą suplementów wapnia.

Badacze wykazali ostatnio ekspresję enzymów metabolizujących VDR i VD w ludzkich jądrach, drogach wytryskowych oraz w dojrzałych plemnikach. Następnie badacze wykazali, że VD w stężeniach fizjologicznych zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom wapnia w plemnikach. VD działa poprzez szybką odpowiedź niegenomową, a indukowany przez VD wzrost wapnia może mieć kluczowe znaczenie dla plemników, ponieważ VD indukuje ruchliwość plemników i reakcję akrosomalną. Analiza ekspresji plemników płodnych i niepłodnych mężczyzn wykazała, że ​​mężczyźni z upośledzoną jakością nasienia mają mniej zdolnych do metabolizowania VD niż normalni mężczyźni (p < 0,0005), co czyni obecność jednego z białek potencjalnym markerem jakości nasienia. Co więcej, badacze właśnie zakończyli badanie przekrojowe 300 młodych mężczyzn z populacji ogólnej i stwierdzili, że niska VD w surowicy była związana ze zmniejszoną ruchliwością i morfologią plemników.

USTAWIENIE, PLAN NAUKOWY I REKRUTACJA Uczestnicy zostaną włączeni do grona mężczyzn skierowanych do Departamentu Wzrostu i Rozrodu (dept. GR), Rigshospitalet (RH) w celu oceny niepłodności męskiej

PROJEKT Jest to prospektywna, podwójnie ślepa, randomizowana, kontrolowana próba z dwoma ramionami

Grupa interwencji: Każdy mężczyzna otrzyma jednorazowo doustnie 300 000 IU (7500 ug) cholekalcyferolu (D3) po pobraniu krwi i nasienia oraz wykonaniu badania DXA. Następnie będą otrzymywać tabletki VD zawierające 1400 IU (35 μg) + 500 mg wapnia dziennie przez 3 miesiące. Kontrola telefoniczna po 4 tygodniach i po 3 miesiącach zostanie przeprowadzona kontrola kliniczna i pobranie krwi, a następnie dalsze dzienne przyjmowanie 1400 IU VD + 500 mg wapnia przez dodatkowe 2 miesiące. Pod koniec leczenia, pięć miesięcy po włączeniu, mężczyźni dostarczają dwie próbki nasienia, pobierają próbkę krwi i przeprowadzają badanie DXA.

Grupa otrzymująca placebo: Prześledzi ten sam łańcuch zdarzeń, chociaż VD zostanie zastąpione placebo.

UCZESTNICY Przeprowadzone zostaną badania przesiewowe ~700-800 niepłodnych mężczyzn. Badacze zakładają, że około 340 mężczyzn zostanie wykluczonych, a około 100 mężczyzn nie chce brać udziału. W ten sposób do badania zostanie włączonych 300 mężczyzn, a połowa zostanie losowo przydzielona do aktywnego leczenia VD. Badacze spodziewają się niewielkiego odrzucenia (<20) ze względu na wysoką motywację i brak skutków ubocznych.

ANALIZA I INTERWENCJA Hormony rozrodcze i czynniki wzrostu będą analizowane na wydziale. GR, Rigshospitalet. Podwielokrotność pierwszej próbki krwi zostanie przeanalizowana przed włączeniem do badania, a kolejna będzie przechowywana do analizy w tym samym czasie co druga próbka krwi na końcu badania, aby przezwyciężyć zmienność między testami. Inne analizy surowicy będą analizowane na wydziale biochemii klinicznej Rigshospitalet. Analizy nasienia i skany DXA będą wykonywane w oddz. GR.

OBLICZANIE I STATYSTYKA WIELKOŚCI PRÓBY W naszym badaniu asocjacyjnym z udziałem 300 uczestników badacze byli w stanie wykryć istotną zależność dawka-odpowiedź między statusem VD a ruchliwością i morfologią plemników oraz odkryli istotne różnice między mężczyznami z niskimi i wysokimi poziomami VD. W oparciu o te wyniki, badacze zakładają, że będą w stanie zwiększyć poziomy VD w surowicy za pomocą 50 nM z naszą konfiguracją. Włączenie 150 mężczyzn do każdej grupy umożliwi nam wykrycie zmian w ruchliwości i morfologii plemników o 15% oraz 25% zmianę poziomu inhibiny B. Zastosowane zostaną zasady dotyczące zamiaru leczenia, a analizy współzmiennych zostaną wykorzystane do analizy potencjalnego wpływu VD.

ANALIZA BIOSTATYSTYCZNA Wszystkie analizy zostaną przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Dobrej Praktyki Klinicznej oraz podstawowe analizy w populacji przeznaczonej do leczenia, która obejmowała wszystkich pacjentów, którzy przeszli randomizację i otrzymali pierwszą dawkę leku w dniu 1. Przeanalizujemy dane na 3 sposoby. Podstawowa analiza zostanie przeprowadzona zgodnie z randomizowanym przydziałem grup dawki witaminy D i wapnia. Analiza drugorzędowa będzie oparta na stratyfikacji mężczyzn zgodnie z analizami podgrup w odniesieniu do wstępnie zdefiniowanych pierwszorzędowych i drugorzędowych punktów końcowych, podczas gdy ostatnia analiza będzie próbowała wyjaśnić wszelkie zależności dawka-odpowiedź. Autor (JHP), który był statystykiem w badaniu i nie był świadomy zadań w grupie badawczej, przeprowadzi pierwotną analizę.

Analiza danych i jakość Głównymi punktami końcowymi dla tego protokołu będą zmiany w jakości nasienia, zwłaszcza ruchliwości plemników, a następnie koncentracji plemników, morfologii i objętości nasienia. Istnieje wiele drugorzędowych punktów końcowych, ale w ramach wstępnego badania nacisk zostanie położony na zmiany następujących drugorzędowych punktów końcowych: DFI plemników, odsetek ciąż, inhibina B, witamina D i homeostaza wapnia. Pacjenci, którzy zakończą uczestnictwo po wizycie w 90 dniu, ale przed 150 dniem wizyty, zostaną włączeni do analizy danych do dnia 90. Mężczyźni, którzy dostarczyli tylko jedną próbkę nasienia lub którym brakuje danych podczas dowolnej wizyty, nadal zostaną uwzględnieni w analizie. Mężczyźni z gorączką do 3 miesięcy przed badaniem nasienia będą uważani za potencjalnego czynnika zakłócającego. Mężczyźni niespełniający kryteriów zawartych w protokole zostaną wykluczeni z analizy. Wartości te zostaną następnie przeniesione do analiz. Zastosowano poziom istotności 5%. W przypadku analiz pierwotnych dodatkowo obliczana jest poprawka wartości p Bonferronu-Holma. Do analizy wtórnej nie stosuje się wielokrotnej korekty testu. Zamiast tego wyniki są omawiane w świetle wielu sytuacji testowych.

1. Analizy między placebo a substancją czynną Analizy między grupami placebo a witamina D + wapń: Pierwszym krokiem będzie porównanie zmian w głównych wynikach w obu grupach placebo i witamina D + wapń. Ta analiza pokaże, czy istnieje znacząca różnica między grupami. W przypadku wyników mierzonych wielokrotnie będzie to wymagało porównania oszacowanych nachyleń lub tempa zmian każdego wyniku między grupami. Modele mieszane pozwalają na odpowiednie włączenie korelacji między powtarzanymi obserwacjami od linii bazowej, dnia 1, dnia 90, dnia 150 od każdego mężczyzny do oszacowania parametrów. Dla wszystkich punktów końcowych mierzonych na linii podstawowej iw dniu 150, sparowane testy t zostaną wykorzystane do oceny, czy istnieje istotna różnica między grupami i określenia, czy średnia zmiana w każdej grupie różni się znacząco od zera. W obu przypadkach dane zostaną przekształcone w miarę potrzeb, aby spełnić założenia modelu. Następnie ta sama analiza zostanie przeprowadzona przy użyciu regresji wielokrotnej z odpowiednimi czynnikami zakłócającymi, takimi jak pora roku, BMI, palenie tytoniu, czas trwania abstynencji, czas od wytrysku do oceny ruchliwości, gorączka itp., aby sprawdzić, czy zmienia to wyniki W przypadku zmierzonych wyników, których nie można w porównaniu z testem t lub innymi testami parametrycznymi w dniu 1, dniu 90 i dniu 150, grupy zostaną porównane przy użyciu testów nieparametrycznych, takich jak test Wilcoxona Manna-Whitneya. W przypadku wyniku binarnego dane zostaną porównane między dwiema grupami za pomocą warunkowej analizy logistyczno-regresyjnej z korektą pod kątem odpowiednich czynników zakłócających (zdefiniowanych jako istotnie powiązane p<0,05).

   .

2. Analizy po rozwarstwieniu na podgrupy Uczestnicy zostaną pogrupowani według BMI, wapnia, sezonu, jakości nasienia, czynników kostnych, BMD lub poziomu witaminy D, a wpływ placebo w porównaniu z substancją czynną zostanie oceniony w dniu 90 i dniu 150. Analiza podgrup zostanie przeprowadzona zgodnie z normalną praktyką kliniczną i podziałem na odpowiednie grupy zgodnie z klinicznym (25OHD < 25 nmol/l, BMI <25, 25-30, >30 itd.), tercylami/kwartylami/kwintylami lub najwyższym/najniższym w porównaniu z pozostawaniem na linii podstawowej.
3. Analiza danych w celu porównania zmian poziomu witaminy D i wapnia Porównamy również zależności dawka-odpowiedź między zmianami poziomu witaminy D i wapnia oraz pierwszorzędowymi i drugorzędowymi punktami końcowymi między placebo a grupą substancji czynnych iu wszystkich mężczyzn. Określimy wartości delta dla krążących progenitorów witaminy D, jonów wapnia, wapnia całkowitego i wapnia skorygowanego o albuminy od początku do 90 dni i 150 dni i porównamy różnicę z obserwowanymi zmianami w pierwszorzędowych i drugorzędowych punktach końcowych. Przewidujemy, że nie ma różnicy w kształtach krzywej dawka-odpowiedź między różnymi punktami końcowymi, tj. będą one równoległe i liniowe przynajmniej po przekształceniu danych. Następnie ta sama analiza zostanie przeprowadzona przy użyciu odpowiednich czynników zakłócających, takich jak pora roku, BMI, palenie tytoniu, czas trwania abstynencji, czas od wytrysku do oceny ruchliwości itp., aby sprawdzić, czy zmienia to wyniki.

PRZESIEW I PRZEBIEG CZASOWY Mężczyźni, którzy są badani na oddz. GR z powodu niepłodności zostaną poddani badaniu przesiewowemu pod kątem zakwalifikowania do badania, a osoby spełniające kryteria uczestnictwa zostaną poinformowane i jeśli wyrażą zgodę, zostaną przydzielone do aktywnego leczenia VD lub placebo. Alokacja zostanie wykonana przez minimalizację przy użyciu minim, aby uniknąć niezrównoważonego grupowania z powodu niepowodzenia randomizacji. Zrównoważone zostaną następujące zmienne: stężenie plemników, BMI, inhibina-B w surowicy i poziom VD.

ETYKA I SKUTKI UBOCZNE Wszyscy pacjenci zakończą badanie, zanim zostaną zaproszeni do badania. Zostaną poinformowani o potencjalnych skutkach ubocznych, oznakach zatrucia i będą mogli opuścić badanie w dowolnym momencie bez żadnych konsekwencji. Badanie będzie przebiegać zgodnie z „dobrą praktyką kliniczną”. Leczenie VD praktycznie nie daje skutków ubocznych, a ryzyko zatrucia prawie nie istnieje w sugerowanych warunkach, przy stosunkowo niskich dawkach VD i ścisłym monitorowaniu VD i poziomu wapnia. Uczestnicy zostaną wystawieni na doustne VC/placebo, 2 skany DXA, zostaną pobrane 3 dodatkowe próbki krwi i zostaną dostarczone 2 dodatkowe próbki nasienia. Wszyscy uczestnicy zostaną poinformowani i udzielą porad zgodnie z ich statusem VD.

PUBLIKACJA WYNIKÓW Wszystkie wyniki, pozytywne lub negatywne, zostaną przesłane do recenzowanych czasopism naukowych. Dane będą sukcesywnie pozyskiwane i przekazywane do bazy statystycznej.

ZAGADNIENIA PRAKTYCZNE Departament GR bada rocznie ponad 500 niepłodnych mężczyzn. Z tej grupy zostaną włączeni uczestnicy. Oddział posiada wiedzę kliniczną, doświadczenie i możliwości do wykonania wszystkich badań, z wyjątkiem pomiarów niektórych próbek krwi, które będą analizowane przez dział biochemii klinicznej. Zawiesiny doustne VD i placebo zakupiono od Glostrup apotek, podczas gdy tabletki VD i placebo zakupiono od Ferrosan, MD Martin. Badacze współpracują z profesorem nadzwyczajnym biostatystyki J.H. Petersena z Uniwersytetu w Kopenhadze.