Suplementace vitaminu D a mužská neplodnost: CBG studie a randomizovaná klinická studie

Východiska V roce 2008 bylo přibližně 8 % všech novorozenců počato asistovanou reprodukcí. Intracytoplazmatická injekce spermatu (ICSI) představuje ~50 % všech léčebných postupů a používá se hlavně v případech výrazně snížené kvality spermatu. To je v mnoha případech s největší pravděpodobností způsobeno prenatálními faktory nepříznivě ovlivňujícími vyvíjející se varlata, a proto je nepravděpodobné, že by jakákoli léčba dospělých mužů byla schopna zcela normalizovat kvalitu jejich spermatu. Méně by však bylo také klinicky relevantní. Pokud by bylo možné zlepšit sníženou kvalitu spermatu před asistovanou reprodukcí, bylo by zapotřebí méně invazivní léčby. Např. klasické in vitro fertilizace (IVF) spíše než ICSI, jednoduchá intrauterinní inseminace (IUI) spíše než IVF nebo přirozené početí spíše než IUI.

Na produkci a zrání spermií se podílí několik endokrinních faktorů, ale o potenciální roli VD je známo jen málo. VD je klíčovým regulátorem homeostázy vápníku a mineralizace kostí, ačkoli exprese receptoru vitaminu D (VDR) v různých tkáních souvisí s několika různými účinky. VD ovlivňuje reprodukci u několika druhů zvířat, přesvědčivě prokázáno u hlodavců, kde nedostatek VD u samců potkanů ​​vedl ke snížení počtu spermií a samice potkanů ​​inseminované spermatem samců potkanů ​​s deficitem VD měly nižší míru plodnosti. Zhoršená reprodukční výkonnost je reverzibilní a lze ji upravit buď dodáním VD, nebo normalizací hladin vápníku. Podporováno VDR knockout myšmi, které vykazovaly snížený počet spermií, sníženou pohyblivost spermií a histologické abnormality varlat, které lze na rozdíl od samců potkanů ​​s deficitem VD pouze částečně obnovit doplňky vápníku.

Výzkumníci nedávno prokázali expresi VDR a enzymů metabolizujících VD v lidských varlatech, ejakulačním traktu a ve zralých spermiích. Výzkumníci následně prokázali, že VD ve fyziologických koncentracích zvyšuje intracelulární vápník ve spermiích. VD působí prostřednictvím rychlé negenomické reakce a zvýšení vápníku vyvolané VD může být pro spermie zásadní, protože pohyblivost spermií a akrozomová reakce indukuje VD. Expresní analýza spermií od fertilních a neplodných mužů ukázala, že muži se zhoršenou kvalitou spermatu mají méně schopných metabolizovat VD než normální muži (p < 0,0005), díky čemuž je přítomnost jednoho z proteinů potenciálním markerem kvality spermatu. Kromě toho výzkumníci právě dokončili průřezovou studii 300 mladých mužů z obecné populace a zjistili, že nízká VD v séru byla spojena se sníženou pohyblivostí a morfologií spermií.

STANOVENÍ, VĚDECKÝ PLÁN A NÁBOR Účastníci budou zařazeni mezi muže, kteří budou zařazeni do oddělení pro růst a reprodukci (odd. GR), Rigshospitalet (RH) pro hodnocení mužské neplodnosti.

NÁVRH Toto je prospektivní, dvojitě zaslepená, dvouramenná randomizovaná kontrolovaná studie

Skupina intervencí: Každý muž dostane 300 000 IU (7500 ug) cholekalciferolu (D3) perorálně jednou po odběru krve a spermatu a provedeném DXA skenu. Poté budou dostávat VD tablety 1 400 IU (35 ug) + 500 mg vápníku denně po dobu 3 měsíců. Telefonická kontrola po 4 týdnech a po 3 měsících bude provedena klinická kontrola a odběr krve s následným pokračujícím denním příjmem 1400 IU VD + 500 mg vápníku po dobu dalších 2 měsíců. Na konci léčby pět měsíců po zařazení muži dodají dva vzorky spermatu, je jim odebrán vzorek krve a provede se DXA sken.

Skupina dostávající placebo: Bude následovat stejný řetězec událostí, i když VD bude nahrazeno placebem.

ÚČASTNÍCI Bude proveden screening ~700-800 neplodných mužů. Vyšetřovatelé předpokládají, že bude vyloučeno ~340 mužů a ~100 mužů si nepřeje zúčastnit se. Do studie tedy bude zahrnuto 300 mužů a polovina bude randomizována k aktivní léčbě VD. Vyšetřovatelé očekávají malý výpadek (< 20) kvůli vysoké motivaci a bez nežádoucích účinků.

ANALÝZA A INTERVENCE Reprodukční hormony a růstové faktory budou analyzovány na odd. z GR, Rigshospitalet. Před zařazením do studie bude analyzován alikvot prvního krevního vzorku a další bude analyzován současně s druhým krevním vzorkem na konci pokusu, aby se překonaly rozdíly mezi testy. Další sérové ​​analýzy budou analyzovány na oddělení klinické biochemie, Rigshospitalet. Rozbory spermatu a DXA skeny budou provedeny na odd. z GR.

VÝPOČET VELIKOSTI VZORKŮ A STATISTIKY V naší asociační studii s 300 účastníky jsou výzkumníci schopni detekovat významný vztah závislosti odpovědi na dávce mezi stavem VD a pohyblivostí a morfologií spermií a zjistili významné rozdíly mezi muži s nízkou a vysokou hladinou VD. Na základě těchto výsledků vědci předpokládají, že jsou schopni zvýšit sérové ​​hladiny VD o 50 nM s naším nastavením. Zahrnutí 150 mužů do každé skupiny nám umožní detekovat změny v motilitě a morfologii spermií o 15% a 25% změnu v hladinách Inhibinu B. K analýze potenciálního účinku VD budou použity principy Intent to treat a kovariační analýzy.

BIOSTISTICKÁ ANALÝZA Všechny analýzy budou provedeny podle pokynů správné klinické praxe a primárních analýz v populaci s úmyslem léčit, která zahrnovala všechny pacienty, kteří podstoupili randomizaci a dostali první dávku léku v den 1. Data budeme analyzovat 3 způsoby. Primární analýza bude probíhat podle randomizované skupiny s dávkou vitaminu D a vápníku. Sekundární analýza bude založena na stratifikaci mužů podle analýz podskupin ve vztahu k předem definovaným primárním a sekundárním cílům, zatímco poslední analýza se pokusí objasnit jakýkoli vztah mezi dávkou a odezvou. Primární analýzu provede autor (JHP), který byl statistikem studie a neznal zadání studijní skupiny.

Analýza a kvalita dat Primárními cílovými body pro tento protokol budou změny kvality spermatu, zejména motility spermatu, následované koncentrací spermií, morfologií a objemem spermatu. Existuje mnoho sekundárních cílových bodů, ale pro počáteční výzkum se zaměříme na změny následujících sekundárních cílových bodů: DFI spermií, míra těhotenství, inhibin B, vitamin D a homeostáza vápníku. Subjekty, které ukončí účast po návštěvě po 90 dnech, ale před návštěvním dnem 150, budou zahrnuty do analýzy dat až do 90. dne. Muži, kteří dodají pouze jeden vzorek spermatu nebo mají chybějící údaje při jakékoli návštěvě, budou stále zahrnuti do analýzy. Muži s horečkou do 3 měsíců před analýzou spermatu budou považováni za potenciálního matoucího. Muži, kteří nesplňují kritéria v protokolu, budou z analýzy vyloučeni. Tyto hodnoty budou následně přeneseny do analýz. Používá se hladina významnosti 5 %. Pro primární analýzy je dodatečně vypočítána korekce p-hodnoty Bonferronu-Holm. Pro sekundární analýzu se nepoužívá vícenásobná korekce testu. Místo toho jsou výsledky diskutovány s ohledem na různé testovací situace.

1. Analýzy mezi placebem versus účinnou látkou Mezi skupinovými analýzami placebo versus vitamín D + vápník: Prvním krokem bude srovnání změn v primárních výsledcích napříč dvěma skupinami placebo versus vitamín D + vápník. Tato analýza ukáže, zda existuje významný rozdíl mezi skupinami. U výsledků měřených opakovaně to bude vyžadovat porovnání odhadovaných sklonů nebo rychlostí změn každého výsledku mezi skupinami. Smíšené modely umožňují, aby korelace mezi opakovanými pozorováními výchozího stavu 1 den 90 dnů 150 od každého muže byla vhodně začleněna do odhadu parametrů. Pro všechny koncové body měřené na začátku a 150. den se použijí párové t-testy k posouzení, zda existuje významný rozdíl mezi skupinami, a ke stanovení, zda se průměrná změna v každé skupině významně liší od nuly. V obou případech budou data podle potřeby transformována tak, aby splňovala předpoklady modelu. Poté bude provedena stejná analýza pomocí vícenásobné regrese s relevantními faktory, jako je sezóna, BMI, kouření, délka abstinence, doba od ejakulace do hodnocení motility, horečka atd., aby se zjistilo, zda to změní výsledky. ve srovnání s t-testem nebo jinými parametrickými testy v den 1, den 90 a den 150 budou skupiny porovnány pomocí neparametrických testů, jako je Wilcoxon Mann-Whitney test. Pro binární výsledek budou data porovnána mezi těmito dvěma skupinami pomocí podmíněné logisticko-regresní analýzy s úpravou na relevantní zmatky (definované jako významně asociované s p<0,05).

   .

2. Analýzy po stratifikaci do podskupin Subjekty budou seskupeny podle jejich BMI, vápníku, sezóny, kvality spermatu, kostních faktorů, BMD nebo hladin vitaminu D a účinek placeba oproti účinné látce bude hodnocen 90. a 150. den. Analýzy podskupin budou v souladu s běžnou klinickou praxí a stratifikací do příslušných skupin podle klinického (25OHD < 25 nmol/l, BMI <25, 25-30, >30 atd.), tertilů/kvartilů/kvintilů nebo nejvyšší/nejnižší oproti setrvání na základní linii.
3. Analýza dat pro srovnání změn vitaminu D a vápníku Porovnáme také vztahy dávka-odpověď mezi změnami vitaminu D a vápníku a primárními a sekundárními cílovými parametry mezi skupinou placeba a aktivní látky a u všech mužů. Stanovíme hodnoty delta pro cirkulující progenitory vitaminu D, ionty vápníku, celkový vápník a vápník korigovaný na albumin od začátku do 90 dnů a 150 dnů a porovnáme rozdíl s pozorovanými změnami v primárních a sekundárních endpointech. Předpokládáme, že neexistuje žádný rozdíl ve tvarech křivky dávka-odpověď mezi různými koncovými body, tj. budou paralelní a lineární alespoň po transformaci dat. Poté bude provedena stejná analýza s použitím relevantních faktorů, jako je sezóna, BMI, kouření, délka abstinence, doba od ejakulace do hodnocení motility atd., aby se zjistilo, zda to změní výsledky.

PROHLÍDKA A ČASOVÝ KURZ Muži, kteří jsou vyšetřováni na odd. GR z důvodu neplodnosti bude podroben screeningu na způsobilost ke studii a ti, kteří splňují kritéria pro účast, budou informováni, a pokud souhlasí s přidělením aktivní léčby VD nebo placebem. Alokace bude provedena minimalizací pomocí minima, aby se zabránilo nevyváženému seskupování v důsledku selhání randomizace. Budou vyváženy následující proměnné: koncentrace spermií, BMI, sérový inhibin-B a hladina VD.

ETIKA A NEŽÁDOUCÍ ÚČINKY Všichni pacienti dokončí své vyšetření, než budou pozváni do studie. Budou informováni o možných nepříznivých účincích, známkách intoxikace a mohou kdykoli opustit zkoušku bez jakýchkoli následků. Zkouška bude probíhat v souladu se „správnou klinickou praxí“. Léčba VD nemá prakticky žádné vedlejší účinky a riziko intoxikace v navrhovaném uspořádání téměř neexistuje, s relativně nízkými dávkami VD a pečlivým sledováním VD a stavu vápníku. Účastníci budou vystaveni orálnímu VC/placebu, 2 skenům DXA, budou jim odebrány 3 vzorky krve navíc a dodány 2 vzorky spermatu navíc. Všichni účastníci budou informováni a budou jim poskytnuty rady podle jejich statusu VD.

ZVEŘEJNĚNÍ VÝSLEDKŮ Všechny výsledky, pozitivní i negativní, budou zaslány do recenzovaných vědeckých časopisů. Data budou postupně získávána a přenášena do statistické databáze.

PRAKTICKÉ OTÁZKY Oddělení GR vyšetřuje ročně více než 500 neplodných mužů. Účastníci budou zařazeni z této skupiny. Oddělení má klinickou odbornost, zkušenosti a kapacitu pro provádění všech vyšetření s výjimkou měření některých krevních vzorků, které bude analyzovat oddělení klinické biochemie. VD a placebo perorální suspenze jsou zakoupeny od Glostrup apotek, zatímco VD a placebo tablety jsou zakoupeny od Ferrosan, MD Martin. Řešitelé spolupracují s docentem biostatistiky J.H. Petersen, Univerzita v Kodani.