Vitamin D-tilskudd og mannlig infertilitet: CBG-studien en randomisert klinisk studie

Bakgrunn I 2008 ble omtrent 8 % av alle nyfødte barn unnfanget ved assistert befruktning. Intracytoplasmatisk spermieinjeksjon (ICSI) utgjør ~50 % av alle behandlinger og brukes hovedsakelig i tilfeller med sterkt redusert sædkvalitet. Dette er i mange tilfeller mest sannsynlig forårsaket av prenatale faktorer som påvirker de utviklende testiklene negativt, og det er derfor lite sannsynlig at noen behandling av voksne menn vil kunne normalisere sædkvaliteten deres fullstendig. Men mindre vil også være klinisk relevant. Hvis redusert sædkvalitet kunne forbedres før assistert befruktning, ville en mindre invasiv behandling være nødvendig. F.eks. klassisk in vitro fertilisering (IVF) i stedet for ICSI, enkel intrauterin inseminasjon (IUI) i stedet for IVF eller naturlig unnfangelse i stedet for IUI.

Flere endokrine faktorer har vært involvert i sædproduksjon og -modning, men lite er kjent om den potensielle rollen til VD. VD er en nøkkelregulator for kalsiumhomeostase og benmineralisering, selv om ekspresjon av vitamin D-reseptoren (VDR) i forskjellige vev har vært relatert til flere forskjellige handlinger. VD påvirker reproduksjonen hos flere dyrearter, overbevisende vist hos gnagere, der VD-mangel hos hannrotter resulterte i reduserte sædceller, og hunnrotter inseminert med sæd fra VD-mangelfulle hannrotter hadde lavere fruktbarhet. Den nedsatte reproduksjonsevnen er reversibel og kan korrigeres enten ved å tilføre VD eller ved å normalisere kalsiumnivået. Støttet av VDR knockout-mus, som viste reduserte spermateller, redusert spermmotilitet og histologiske abnormiteter i testis, som i motsetning til VD-mangelfulle hannrotter bare delvis kan gjenopprettes med kalsiumtilskudd.

Etterforskerne har nylig vist uttrykk for VDR og VD-metaboliserende enzymer i den menneskelige testiklene, ejakulasjonskanalen og i modne spermatozoer. Etterforskerne viste deretter at VD i fysiologiske konsentrasjoner økte intracellulært kalsium i sædceller. VD virker gjennom en rask ikke-genomisk respons og den VD-induserte økningen i kalsium kan være avgjørende for spermatozoene, fordi VD induserte sædmotilitet og akrosomreaksjonen. Ekspresjonsanalyse av spermatozoer fra fertile og infertile menn viste at menn med nedsatt sædkvalitet har færre som kan metabolisere VD enn normale menn (p < 0,0005), noe som gjør tilstedeværelsen av ett av proteinene til en potensiell markør for sædkvalitet. Videre har etterforskerne nettopp fullført en tverrsnittsstudie av 300 unge menn fra den generelle befolkningen og funnet at lav serum-VD var assosiert med redusert spermmotilitet og morfologi.

INNSTILLINGER, VITENSKAPLIG PLAN OG REKRUTTERING Deltagerne vil inkluderes blant menn henvist til Avdeling for vekst og reproduksjon (avd. GR), Rigshospitalet (RH) for evaluering av mannlig infertilitet

DESIGN Dette er en prospektiv, dobbeltblindet, to-arms randomisert kontrollert studie

Intervensjonsgruppe: Hver mann vil motta 300 000 IE (7500 ug) kolekalsiferol (D3) oralt én gang etter blod- og sædprøvetaking og utført DXA-skanning. Deretter vil de motta VD-tabletter på 1400 IE (35 ug) + 500 mg kalsium daglig i 3 måneder. Telefonkontroll etter 4 uker og etter 3 måneder vil bli utført klinisk kontroll og blodprøvetaking, etterfulgt av fortsatt daglig inntak av 1400 IE VD + 500 mg kalsium i ytterligere 2 måneder. Ved avsluttet behandling fem måneder etter inkludering leverer mennene to sædprøver, får tatt en blodprøve og utført en DXA-skanning.

Gruppe som får placebo: Vil følge samme hendelseskjede, selv om VD vil bli erstattet med placebo.

DELTAKER Screening av ~700-800 infertile menn vil bli utført. Etterforskerne antar at ~340 menn vil bli ekskludert og ~100 menn ikke ønsker å delta. Dermed vil 300 menn inkluderes i studien og halvparten vil bli randomisert til aktiv VD-behandling. Etterforskerne forventer et lite frafall (< 20) på grunn av høy motivasjon og ingen bivirkninger.

ANALYSE OG INTERVENSJON Reproduktive hormoner og vekstfaktorer vil bli analysert ved avd. av GR, Rigshospitalet. En alikvot av den første blodprøven vil bli analysert før inkludering i studien og en annen oppbevart for å bli analysert samtidig som den andre blodprøven på slutten av forsøket for å overvinne interanalysevariasjonen. Øvrige serumanalyser vil bli analysert ved avdeling for klinisk biokjemi, Rigshospitalet. Sædanalyser og DXA-skanninger vil bli utført ved avd. av GR.

BEREGNING AV PRØVESTØRRELSE OG STATISTIKK I vår assosiasjonsstudie med 300 deltakere er etterforskerne i stand til å oppdage signifikant doseresponsforhold mellom VD-status og sædmotilitet og morfologi, og fant signifikante forskjeller mellom menn med lave og høye VD-nivåer. Basert på disse resultatene antar etterforskerne å kunne øke serumnivåene av VD med 50 nM med vårt oppsett. Å inkludere 150 menn i hver gruppe vil gjøre oss i stand til å oppdage endringer i sædmotilitet og morfologi på 15 % og en 25 % endring i inhibin B-nivåer. Intention to treat-prinsipper vil bli brukt og samvariante analyser vil bli brukt for å analysere potensiell effekt av VD.

BIOSTATISTISK ANALYSE Alle analysene vil bli utført i henhold til retningslinjer for god klinisk praksis og primæranalysene i intention-to-treat-populasjonen, som inkluderte alle pasienter som gjennomgikk randomisering og fikk første dose medisin på dag 1. Vi vil analysere dataene på 3 måter. Den primære analysen vil fortsette i henhold til den randomiserte vitamin D- og kalsiumdosegruppen. Sekundæranalysen vil være basert på å stratifisere mennene etter undergruppeanalyser i forhold til de forhåndsdefinerte primære og sekundære endepunktene, mens den siste analysen vil forsøke å belyse en eventuell dose-respons sammenheng. En forfatter (JHP) som var statistiker for studien og uvitende om studiegruppeoppgavene vil utføre den primære analysen.

Dataanalyse og kvalitet De primære endepunktene for denne protokollen vil være endringer i sædkvalitet, spesielt sædmotilitet etterfulgt av sædkonsentrasjon, morfologi og sædvolum. Det finnes flere sekundære endepunkter, men for den innledende undersøkelsen vil fokus være på endringer av følgende sekundære endepunkter: Sperm DFI, graviditetsrate, Inhibin B, vitamin D og kalsiumhomeostase. Forsøkspersoner som avslutter deltakelse etter besøk 90 dager men før besøksdag 150 vil bli inkludert for dataanalyse frem til dag 90. Menn som bare leverer én sædprøve eller som mangler data ved ethvert besøk vil fortsatt inkluderes i analysen. Menn med feber opptil 3 måneder før sædanalyse vil bli vurdert som en potensiell konfounder. Menn som ikke oppfyller kriteriene i protokollen vil bli ekskludert fra analysen. Disse verdiene vil deretter bli videreført for analyser. Det benyttes et signifikansnivå på 5 %. For primæranalysene beregnes Bonferronu-Holm p-verdikorreksjon i tillegg. For den sekundære analysen brukes ingen multiple testkorreksjon. I stedet diskuteres resultatene i lys av de mange testsituasjonene.

1. Analyser mellom placebo versus virkestoff Mellom gruppe analyser placebo versus vitamin D + kalsium: Det første trinnet vil være å sammenligne endringene i primære utfall på tvers av de to gruppene placebo versus vitamin D + kalsium. Denne analysen vil vise om det er en signifikant forskjell mellom gruppene. For utfall målt gjentatte ganger, vil dette innebære å sammenligne de estimerte stigningene, eller endringsratene, for hvert utfall mellom gruppene. Blandede modeller tillater at korrelasjonen mellom de gjentatte observasjonene baseline-dag 1-dag 90-dag 150 fra hver mann kan innlemmes på passende måte i parameterestimering. For alle endepunkter målt ved baseline og dag 150, vil parede t-tester bli brukt for å vurdere det er en signifikant forskjell mellom gruppene og avgjøre om gjennomsnittsendringen innen hver gruppe skiller seg signifikant fra null. I begge tilfeller vil data transformeres etter behov for å møte modellens forutsetninger. Etterpå vil den samme analysen bli utført ved å bruke multippel regresjon med relevante konfoundere som sesong, BMI, røyking, varighet av abstinens, tid fra utløsning til motilitetsvurdering, feber etc. for å se om dette endrer resultatene For målte utfall som ikke kan sammenlignet med t-test eller andre parametriske tester på dag 1, dag 90 og dag 150, vil grupper sammenlignes ved bruk av ikke-parametriske tester som Wilcoxon Mann-Whitney test. For binært utfall vil dataene bli sammenlignet mellom de to gruppene ved hjelp av betinget logistisk-regresjonsanalyse med justering for relevante konfoundere (definert som signifikant p<0,05 assosiert).

   .

2. Analyser etter stratifisering i undergrupper Forsøkspersonene vil bli gruppert i henhold til deres BMI, kalsium, sesong, sædkvalitet, benfaktorer, BMD eller vitamin D-nivåer, og effekten av placebo versus aktiv substans vil bli evaluert på dag 90 og dag 150. Undergruppeanalysene vil i henhold til vanlig klinisk praksis og stratifisering i passende grupper etter klinisk (25OHD < 25 nmol/l, BMI <25, 25-30, >30 etc.), tertiler/kvartiler/kvintiler eller høyest/laveste versus å forbli ved baseline.
3. Dataanalyse for sammenligning av endringer i vitamin D og kalsium Vi vil også sammenligne dose-respons sammenhenger mellom endringer i vitamin D og kalsium og primære og sekundære endepunkter mellom placebo og virkestoffgruppe og hos alle menn. Vi vil bestemme delta-verdier for sirkulerende vitamin D-progenitorer, kalsiumion, totalt kalsium og albuminkorrigert kalsium fra start til 90 dager og 150 dager og sammenligne forskjellen med de observerte endringene i primære og sekundære endepunkter. Vi forventer at det ikke er noen forskjell i formene på dose-responskurven mellom de forskjellige endepunktene, dvs. de vil være parallelle og lineære i det minste etter transformasjon av dataene. Etterpå vil den samme analysen bli utført ved å bruke relevante konfoundere som sesong, BMI, røyking, varighet av abstinens, tid fra utløsning til motilitetsvurdering etc. for å se om dette endrer resultatene.

SCREENING OG TIDSKURS Menn, som utredes ved avd. av GR på grunn av infertilitet vil bli screenet for kvalifisering til studien, og de som oppfyller kriteriene for deltakelse vil bli informert, og om de samtykker tildelt aktiv behandling med VD eller placebo. Tildeling vil skje ved å minimere ved å bruke minim for å unngå ubalansert gruppering på grunn av randomiseringssvikt. Følgende variabler vil bli balansert: Spermkonsentrasjon, BMI, seruminhibin-B og VD-nivå.

ETIKK OG BIVIRKNINGER Alle pasientene vil ha fullført undersøkelsen før de inviteres til studien. De vil bli informert om potensielle bivirkninger, tegn på rus og de kan forlate rettssaken når som helst uten konsekvenser. Forsøket vil foregå i samsvar med "god klinisk praksis". VD-behandling gir praktisk talt ingen bivirkninger og risikoen for forgiftning er nesten ikke-eksisterende i den foreslåtte settingen, med relativt lave doser av VD og tett overvåking av VD- og kalsiumstatus. Deltakerne vil bli eksponert for oral VC/placebo, for 2 DXA-skanninger, få tatt 3 ekstra blodprøver og levere 2 ekstra sædprøver. Alle deltakere vil bli informert og veiledet i henhold til deres VD-status.

PUBLIKASJON AV RESULTATER Alle resultater, positive eller negative vil bli sendt til fagfellevurderte vitenskapelige tidsskrifter. Data vil suksessivt innhentes og overføres til en statistisk database.

PRAKTISKE SPØRSMÅL Avd. GR undersøker årlig mer enn 500 infertile menn. Deltakere vil bli inkludert fra den gruppen. Avdelingen har klinisk kompetanse, erfaring og kapasitet til å utføre alle undersøkelsene, bortsett fra målingene av noen av blodprøvene, som vil bli analysert av avdeling for klinisk biokjemi. VD og placebo oral suspensjon kjøpes fra Glostrup apotek, mens VD og placebo tabletter kjøpes fra Ferrosan, MD Martin. Etterforskerne samarbeider med førsteamanuensis i biostatistikk J.H. Petersen, Københavns Universitet.