Пищевые добавки с витамином D и мужское бесплодие: исследование CBG и рандомизированное клиническое испытание

Исходная информация В 2008 г. примерно 8% всех новорожденных детей были зачаты с помощью вспомогательной репродукции. Интрацитоплазматическая инъекция спермы (ИКСИ) составляет около 50% всех методов лечения и в основном используется в случаях значительного снижения качества спермы. Во многих случаях это, скорее всего, вызвано пренатальными факторами, неблагоприятно влияющими на развивающиеся яички, и поэтому маловероятно, что какое-либо лечение взрослых мужчин сможет полностью нормализовать качество их спермы. Однако меньшее количество также будет иметь клиническое значение. Если бы снижение качества спермы можно было улучшить до любой вспомогательной репродукции, потребовалось бы менее инвазивное лечение. Например. классическое экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), а не ИКСИ, простая внутриматочная инсеминация (ВМИ), а не ЭКО, или естественное зачатие, а не ВМИ.

Несколько эндокринных факторов вовлечены в продукцию и созревание сперматозоидов, но мало что известно о потенциальной роли ВБ. VD является ключевым регулятором гомеостаза кальция и минерализации костей, хотя экспрессия рецептора витамина D (VDR) в различных тканях связана с несколькими различными действиями. ВД влияет на репродукцию у некоторых видов животных, что убедительно показано на грызунах, где дефицит ВД у самцов крыс приводил к снижению количества сперматозоидов, а самки крыс, осемененные спермой самцов крыс с дефицитом ВД, имели более низкие показатели фертильности. Нарушение репродуктивной функции носит обратимый характер и может быть скорректировано либо введением ВД, либо нормализацией уровня кальция. Подтверждено мышами с нокаутом VDR, которые показали снижение количества сперматозоидов, снижение подвижности сперматозоидов и гистологические аномалии семенников, которые, в отличие от самцов крыс с дефицитом VD, только частично могут быть восстановлены добавками кальция.

Исследователи недавно показали экспрессию ферментов, метаболизирующих VDR и VD, в яичках человека, эякуляторном тракте и в зрелых сперматозоидах. Впоследствии исследователи показали, что ВД в физиологических концентрациях увеличивает внутриклеточный кальций в сперматозоидах. ВД действует посредством быстрого негеномного ответа, и индуцированное ВД повышение уровня кальция может иметь решающее значение для сперматозоидов, поскольку ВД вызывает подвижность сперматозоидов и акросомную реакцию. Анализ экспрессии сперматозоидов фертильных и бесплодных мужчин показал, что у мужчин с нарушенным качеством спермы меньше тех, которые могут метаболизировать ВД, чем у нормальных мужчин (p < 0,0005), что делает присутствие одного из белков потенциальным маркером качества спермы. Кроме того, исследователи только что завершили поперечное исследование 300 молодых мужчин из общей популяции и обнаружили, что низкий VD в сыворотке был связан со сниженной подвижностью и морфологией сперматозоидов.

ПОСТАНОВКА, НАУЧНЫЙ ПЛАН И НАБОР Участники будут включены среди мужчин, направленных в Отдел роста и репродукции (отделение GR), Ригшоспиталет (RH) для оценки мужского бесплодия.

ДИЗАЙН Это проспективное двойное слепое рандомизированное контролируемое исследование с двумя группами.

Группа вмешательства: каждый мужчина получит 300 000 МЕ (7500 мкг) холекальциферола (D3) перорально один раз после взятия проб крови и спермы и выполнения DXA-сканирования. После этого они будут получать таблетки VD по 1400 МЕ (35 мкг) + 500 мг кальция ежедневно в течение 3 месяцев. Контроль по телефону через 4 недели и через 3 месяца будет проведен клинический контроль и забор крови, после чего продолжится ежедневный прием 1400 МЕ ВД + 500 мг кальция в течение 2 дополнительных месяцев. В конце лечения через пять месяцев после включения мужчины сдают два образца спермы, у них берут образец крови и проводят DXA-сканирование.

Группа, получающая плацебо: будет следовать той же цепочке событий, хотя ВД будет заменено плацебо.

УЧАСТНИКИ Будет проведен скрининг около 700-800 бесплодных мужчин. Исследователи предполагают, что ~340 мужчин будут исключены, а ~100 человек не захотят участвовать. Таким образом, в исследование будет включено 300 мужчин, и половина из них будет рандомизирована для активного лечения ВБ. Исследователи ожидают небольшой отсев (< 20) из-за высокой мотивации и отсутствия побочных эффектов.

АНАЛИЗ И ВМЕШАТЕЛЬСТВО Репродуктивные гормоны и факторы роста будут проанализированы в отд. ГР, Ригшоспиталет. Аликвоту первого образца крови будут анализировать перед включением в исследование, а другой образец оставят для анализа одновременно со вторым образцом крови в конце испытания, чтобы преодолеть различия между анализами. Другие анализы сыворотки будут проанализированы на кафедре клинической биохимии Ригшоспиталет. Анализы спермы и DXA-сканирование будут выполняться в отд. ГР.

РАСЧЕТ ОБЪЕМА ВЫБОРКИ И СТАТИСТИКА В нашем ассоциативном исследовании с участием 300 участников исследователи смогли выявить значимую зависимость доза-реакция между статусом венерической болезни, подвижностью и морфологией сперматозоидов и обнаружили значительные различия между мужчинами с низким и высоким уровнем венерической болезни. Основываясь на этих результатах, исследователи предполагают, что с помощью нашей установки можно повысить уровень VD в сыворотке с помощью 50 нМ. Включение 150 мужчин в каждую группу позволит нам обнаружить изменения в подвижности и морфологии сперматозоидов на 15% и изменение уровня ингибина B на 25%. Будут использоваться принципы намерения лечить, а ковариационный анализ будет использоваться для анализа потенциального эффекта ВД.

БИОСТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Все анализы будут выполняться в соответствии с рекомендациями по надлежащей клинической практике и первичными анализами в популяции, предназначенной для лечения, в которую вошли все пациенты, прошедшие рандомизацию и получившие первую дозу лекарства в 1-й день. Мы проанализируем данные тремя способами. Первичный анализ будет проводиться в соответствии с рандомизированным назначением групп доз витамина D и кальция. Вторичный анализ будет основан на стратификации мужчин в соответствии с анализом подгрупп по отношению к предварительно определенным первичным и вторичным конечным точкам, в то время как последний анализ попытается выяснить любую зависимость доза-реакция. Автор (JHP), который был статистиком исследования и не знал о заданиях исследовательской группы, проведет первичный анализ.

Анализ данных и качество Основными конечными точками для этого протокола будут изменения качества спермы, особенно подвижности сперматозоидов, за которыми следуют концентрация сперматозоидов, морфология и объем спермы. Существует несколько вторичных конечных точек, но для первоначального исследования внимание будет сосредоточено на изменениях следующих вторичных конечных точек: DFI спермы, частота наступления беременности, ингибин B, витамин D и гомеостаз кальция. Субъекты, прекратившие участие после визита на 90-й день, но до 150-го дня визита, будут включены в анализ данных до 90-го дня. Мужчины, которые сдали только один образец спермы или у которых отсутствуют данные при любом посещении, по-прежнему будут включены в анализ. Мужчины с лихорадкой до 3 месяцев до анализа спермы будут рассматриваться как потенциальный источник помех. Мужчины, не соответствующие критериям протокола, будут исключены из анализа. Затем эти значения будут перенесены для анализа. Используется уровень значимости 5%. Для первичных анализов дополнительно рассчитывается поправка Бонферроню-Холма. Для вторичного анализа коррекция множественных тестов не используется. Вместо этого результаты обсуждаются с учетом нескольких ситуаций тестирования.

1. Анализы между плацебо и активным веществом Между групповыми анализами плацебо и витамин D + кальций: Первым шагом будет сравнение изменений в первичных исходах для двух групп плацебо по сравнению с витамином D + кальций. Этот анализ покажет, есть ли существенная разница между группами. Для результатов, измеряемых повторно, это повлечет за собой сравнение предполагаемых наклонов или скоростей изменения каждого результата между группами. Смешанные модели позволяют соответствующим образом включить корреляцию между повторными наблюдениями исходного уровня, 1-го дня, 90-го дня и 150-го дня для каждого мужчины в оценку параметров. Для всех конечных точек, измеренных на исходном уровне и на 150-й день, будут использоваться парные t-тесты, чтобы оценить наличие значительной разницы между группами и определить, значительно ли среднее изменение в каждой группе отличается от нуля. В обоих случаях данные будут преобразованы по мере необходимости, чтобы соответствовать предположениям модели. Затем будет проведен тот же анализ с использованием множественной регрессии с соответствующими искажающими факторами, такими как время года, ИМТ, курение, продолжительность воздержания, время от эякуляции до оценки подвижности, лихорадка и т. д., чтобы увидеть, изменит ли это результаты. по сравнению с t-критерием или другими параметрическими тестами на 1-й, 90-й и 150-й день группы будут сравнивать с использованием непараметрических тестов, таких как критерий Уилкоксона-Манна-Уитни. Для бинарного результата данные будут сравниваться между двумя группами с помощью условного логистического регрессионного анализа с поправкой на соответствующие вмешивающиеся факторы (определяемые как значимо связанные с p<0,05).

   .

2. Анализы после стратификации на подгруппы. Субъекты будут сгруппированы в соответствии с их ИМТ, кальцием, временем года, качеством спермы, костными факторами, BMD или уровнями витамина D, а эффект плацебо по сравнению с активным веществом будет оцениваться на 90-й и 150-й день. Анализы подгрупп будут проводиться в соответствии с обычной клинической практикой и стратификацией в соответствующих группах в соответствии с клиническими данными (25OHD < 25 нмоль/л, ИМТ <25, 25-30, >30 и т. д.), тертилями/квартилями/квинтилями или наивысшими/минимальными по сравнению с тем, чтобы оставаться на исходном уровне.
3. Анализ данных для сравнения изменений уровня витамина D и кальция. Мы также сравним зависимость доза-реакция между изменениями уровня витамина D и кальция, а также первичные и вторичные конечные точки между группами плацебо и активного вещества и у всех мужчин. Мы определим значения дельты для циркулирующих предшественников витамина D, ионов кальция, общего кальция и кальция с поправкой на альбумин от начала до 90 дней и 150 дней и сравним разницу с наблюдаемыми изменениями в первичных и вторичных конечных точках. Мы предполагаем, что между различными конечными точками нет различий в формах кривой доза-реакция, т. е. они будут параллельными и линейными, по крайней мере, после преобразования данных. Впоследствии будет проведен тот же анализ с использованием соответствующих вмешивающихся факторов, таких как время года, ИМТ, курение, продолжительность воздержания, время от эякуляции до оценки подвижности и т. д., чтобы увидеть, изменит ли это результаты.

СКРИНИНГ И ТЕЧЕНИЕ ВРЕМЕНИ Мужчины, находящиеся на обследовании в отд. GR из-за бесплодия будут проверены на предмет приемлемости для участия в исследовании, и те, кто соответствует критериям участия, будут проинформированы, и, если они согласятся, будут назначены на активное лечение VD или плацебо. Распределение будет выполняться путем минимизации с помощью функции minim, чтобы избежать несбалансированного группирования из-за сбоя рандомизации. Будут сбалансированы следующие переменные: концентрация сперматозоидов, ИМТ, ингибин-В в сыворотке и уровень ВД.

ЭТИКА И ПОБОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ Все пациенты должны завершить свое исследование, прежде чем они будут приглашены в исследование. Они будут проинформированы о возможных побочных эффектах, признаках интоксикации и могут покинуть исследование в любой момент без каких-либо последствий. Испытание будет проводиться в соответствии с «надлежащей клинической практикой». Лечение ВД практически не дает побочных эффектов, а риск интоксикации практически отсутствует в предлагаемых условиях, при относительно низких дозах ВД и тщательном мониторинге ВД и кальциевого статуса. Участники будут подвергнуты пероральному приему VC/плацебо, 2 DXA-сканированиям, получат 3 дополнительных образца крови и доставят 2 дополнительных образца спермы. Все участники будут проинформированы и проконсультированы в соответствии с их статусом ВД.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Все результаты, положительные или отрицательные, будут представлены в рецензируемых научных журналах. Данные будут последовательно получены и переданы в статистическую базу данных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ В отделении ЗГ ежегодно обследуются более 500 мужчин с бесплодием. Участники будут включены из этой группы. Отделение обладает клиническими знаниями, опытом и возможностями для проведения всех исследований, за исключением измерений некоторых образцов крови, которые будут проанализированы отделением клинической биохимии. Пероральные суспензии VD и плацебо приобретаются у Glostrup apotek, а таблетки VD и плацебо приобретаются у Ferrosan, MD Martin. Исследователи сотрудничают с доцентом биостатистики Дж.Х. Петерсен, Копенгагенский университет.