不同阶段受子宫内膜异位症影响的妇女子宫内膜异位组织中 M1 和 M2 巨噬细胞的评估。

背景和基本原理：子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病，定义为功能性子宫内膜组织、腺体和间质在子宫腔外的异位存在和生长（Kavoussi 等人，2016 年）。 子宫内膜异位症的发病机制仍然存在争议：免疫、激素、遗传和表观遗传因素都可能参与其中，并且已经提出了几种理论来解释它。

该疾病影响 2-10% 的育龄妇女和 50% 的不育妇女（Dunselman 等人，2014 年），并可能导致盆腔疼痛（Triolo 等人，2013 年；Butticè 等人，2013 年）、异常出血、不孕/不育因此，重要的心理问题 (Laganà et al, 2015)。 子宫内膜异位症根据子宫内膜植入物、斑块、子宫内膜异位瘤和/或粘连的数量、大小和表面和/或深层位置进行分类。 最常用的子宫内膜异位症分类是由美国生殖医学学会制定的（Rock JA，1995），尽管其他分类可用于深层浸润性子宫内膜异位症（Haas 等人，2011）或将子宫内膜异位症与不孕症相关联（Adamson 等人， 2010）。

正如广泛证明的那样（Donnez 等人，2016 年），人们普遍认为中度/重度子宫内膜异位症相关的不育是由于机械因素，即正常骨盆解剖结构的扭曲/破坏。 相反，与轻度/轻度子宫内膜异位症相关的不孕症/生育力低下背后的因素不太清楚。 然而，迄今为止，没有任何假设的机制能够详尽地解释与子宫内膜异位症相关的不孕症，而这种疾病可能是由多种因素共同引起的，包括遗传和表观遗传修饰（Sofo 等人，2015 年；Maniglio 等人，2016 年）。

越来越多的证据（Laganà 等人，2013 年；Laganà 等人，2016 年）表明，受子宫内膜异位症影响的女性的腹膜微环境经历了一些局部炎症修复现象，常驻巨噬细胞的参与以及外周单核细胞的吸引和募集细胞（单核细胞和淋巴细胞）从血液进入腹膜腔：在子宫内膜异位症期间，由细胞因子处理的细胞增殖（Pizzo 等人，2002 年）和细胞凋亡失调（Sturlese 等人，2011 年；Salmeri）引起的子宫内膜和腹膜稳态发生破坏等人，2015 年）。

单核细胞在适应性免疫中起着关键作用，因为它们在感染或炎症部位迁移，在巨噬细胞中分化并充当抗原呈递细胞 (APC)。

自从埃利·梅奇尼科夫 (Elie Metchnikoff) 在墨西拿 (JAMA, 1968) 首次发现吞噬作用以来，在对海星幼虫进行实验后，向前迈出了很多步，使我们能够对巨噬细胞除了作为吞噬细胞的作用之外还有更广泛的了解。

周围的微环境可以解决巨噬细胞向瞬态和可逆极化的可塑性。 这些极化表型反映了促炎或抗炎状态，并可能随时间而改变。 它们可以在功能上分为两个主要群体：“经典激活”巨噬细胞 (M1) 和“交替激活”巨噬细胞 (M2)（Sica & Mantovani，2012）。 尽管人们普遍认为 M1 和 M2 代表巨噬细胞激活全谱的两个末端（Liu 等人，2014 年），但最近的数据（Locati 等人，2013 年；Mantovani 等人，2013 年；Capobianco & Rovere-Querini，2013 年）允许将这两个群体的特征描述如下：

• M1 巨噬细胞：CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• M2 巨噬细胞：CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

研究人群：研究人员将选择受组织学证实的子宫内膜异位症（病例）和卵巢功能性囊肿（对照）影响的患者，他们将接受腹腔镜手术。 根据修订后的美国生殖医学学会子宫内膜异位症分类（Rock JA，1995），将子宫内膜异位症患者分为4组：子宫内膜异位症的轻度、轻度、中度和重度阶段。

所有腹腔镜手术都将在月经周期的增殖期进行。 研究人员将从研究中排除受其他盆腔疾病、慢性循环系统疾病、自身免疫性疾病或肿瘤性疾病影响以及在过去 6 个月内服用过任何抗炎药或激素药或免疫调节药的女性。

组织样品制备和巨噬细胞表征：组织切片（用于病例的子宫内膜异位组织，用于对照的卵巢功能性囊肿）将被切碎并在含有终浓度为 3.4 mg/ml 胰酶、0.1 mg/ml 透明质酸酶和 1.6 mg/ml 的酶混合物中孵育含 2 mg/ml D-葡萄糖的 Hank 缓冲盐溶液 (HBSS) 中的胶原酶 I 在 37°C 下处理 2 小时。 消化后，通过 250 μm 筛网过滤并用 HBSS 洗涤来分散细胞。 组织细胞将被染色并固定用于流式细胞术分析。 在分离巨噬细胞之前，将使用死细胞去除试剂盒从培养物中去除死细胞。 细胞生存力将通过台盼蓝排除来评估。

为了评估巨噬细胞标记物的表面表达，组织样本将被染色用于流式细胞术，使用针对 CD14、CD68、CCR7 和 CD80 的荧光染料偶联单克隆抗体来识别 M1，而使用针对 CD14、CD68、CD163 和 CD206 的荧光染料偶联单克隆抗体来识别 M1 M2。

统计分析：连续变量的正态分布假设将通过 Kolmogorov-Smirnov 检验来检验拟合优度。 所有推论分析都将使用非参数统计检验进行。 组间的非正态分布变量将使用 Kruskal-Wallis 检验进行比较。 统计显着性范围为 P < .05。 此外，研究人员将使用与对照或与每个阶段相比的事后多重比较测试来分析数据。