Valutazione dei macrofagi M1 e M2 nel tessuto endometriosico di donne affette da endometriosi in diversi stadi.

Contesto e fondamento logico: l'endometriosi è una malattia estrogeno-dipendente definita dalla presenza ectopica e dalla crescita di tessuto endometriale funzionale, ghiandole e stroma, al di fuori della cavità uterina (Kavoussi et al, 2016). L'eziopatogenesi dell'endometriosi rimane ancora controversa: fattori immunitari, ormonali, genetici ed epigenetici possono essere tutti coinvolti e sono state proposte diverse teorie per spiegarlo.

La malattia colpisce il 2-10% delle donne in età riproduttiva e il 50% di quelle infertili (Dunselman et al, 2014) e può causare dolore pelvico (Triolo et al, 2013; Butticè et al, 2013), sanguinamento anomalo, infertilità/sterilità e, di conseguenza, importanti problemi psicologici (Laganà et al, 2015). L'endometriosi è classificata in base al numero, alle dimensioni e alla localizzazione superficiale e/o profonda di impianti endometriali, placche, endometriomi e/o aderenze. La classificazione più utilizzata dell'endometriosi è stata sviluppata dall'American Society for Reproductive Medicine (Rock JA, 1995), sebbene un'altra classificazione possa essere utilizzata per l'endometriosi infiltrante profonda (Haas et al, 2011) o per correlare endometriosi e infertilità (Adamson et al, 2010).

Come ampiamente evidenziato (Donnez et al, 2016), è generalmente accettato che la sterilità moderata/severa correlata all'endometriosi sia dovuta a fattori meccanici, ovvero alla distorsione/sovversione della regolare anatomia pelvica. Al contrario, i fattori alla base dell'infertilità/subfertilità correlata all'endometriosi minima/lieve sono meno chiari. Tuttavia, ad oggi nessuno dei meccanismi ipotizzati ha spiegato in modo esaustivo l'infertilità correlata all'endometriosi, mentre è possibile che tale malattia sia causata da molteplici fattori complessivamente, comprese le modificazioni genetiche ed epigenetiche (Sofo et al, 2015; Maniglio et al, 2016).

Evidenze sempre più numerose (Laganà et al, 2013; Laganà et al, 2016) suggeriscono che il microambiente peritoneale delle donne affette da endometriosi subisca una serie di fenomeni infiammatori-riparativi locali, con coinvolgimento di macrofagi residenti, attrazione e reclutamento di cellule mononucleari periferiche cellule (monociti e linfociti) dal sangue nella cavità peritoneale: durante l'endometriosi si verifica una rottura dell'omeostasi endometriale e peritoneale causata dalla proliferazione cellulare indirizzata alle citochine (Pizzo et al, 2002) e dalla disregolazione dell'apoptosi (Sturlese et al, 2011; Salmeri e altri, 2015).

I monociti svolgono un ruolo chiave durante l'immunità adattativa, poiché migrano nei siti di infezione o infiammazione, si differenziano in macrofagi e agiscono come cellule presentanti l'antigene (APC).

Dalla loro prima identificazione della fagocitosi da parte di Elie Metchnikoff a Messina (JAMA, 1968), dopo la sperimentazione sulle larve di stelle marine, molti passi in avanti hanno permesso di avere un'ampia panoramica dei macrofagi al di là del loro ruolo di cellule fagocitiche.

Il microambiente circostante può indirizzare la plasticità dei macrofagi verso una polarizzazione transitoria e reversibile. Questi fenotipi polarizzati riflettono lo stato proinfiammatorio o antinfiammatorio e possono cambiare nel tempo. Potrebbero essere classificati funzionalmente in due popolazioni principali: macrofagi "attivati ​​classicamente" (M1) e macrofagi "attivati ​​alternativamente" (M2) (Sica & Mantovani, 2012). Sebbene sia ampiamente accettato che M1 e M2 rappresentino due terminali dell'intero spettro di attivazione dei macrofagi (Liu et al, 2014), dati recenti (Locati et al, 2013; Mantovani et al, 2013; Capobianco & Rovere-Querini, 2013) ha permesso di caratterizzare queste due popolazioni come segue:

• Macrofagi M1: CD14+ CD68+ CCR7+ CD80+
• Macrofagi M2: CD14+ CD68+ CD163+ CD206+

Popolazione in studio: i ricercatori selezioneranno pazienti affetti da endometriosi istologicamente confermata (casi) e da cisti funzionali ovariche (controlli), che saranno sottoposti a chirurgia laparoscopica. In accordo con la classificazione rivista dell'American Society for Reproductive Medicine per l'endometriosi (Rock JA, 1995), i pazienti endometriosi saranno divisi in 4 gruppi: stadi minimi, lievi, moderati e gravi dell'endometriosi.

Tutta la procedura laparoscopica verrà eseguita durante la fase proliferativa del ciclo mestruale. I ricercatori escluderanno dallo studio le donne affette da altri disturbi pelvici, malattie circolatorie croniche, autoimmuni o neoplastiche e che hanno assunto farmaci antinfiammatori o ormonali o immunomodulatori nei 6 mesi precedenti.

Preparazione del campione di tessuto e caratterizzazione dei macrofagi: Sezioni di tessuto (tessuti endometriosici per i casi, cisti ovariche funzionali per i controlli) saranno tritate e incubate in un cocktail enzimatico contenente concentrazioni finali di 3.4 mg/ml di pancreatina, 0.1 mg/ml di ialuronidasi e 1.6 mg/ml collagenasi I in soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) contenente 2 mg/ml di D-glucosio a 37°C per 2 ore. Dopo la digestione, le cellule saranno disperse filtrando attraverso un setaccio da 250 μm e lavate con HBSS. Le cellule tissutali saranno colorate e fissate per l'analisi citofluorimetrica. Prima dell'isolamento dei macrofagi, le cellule morte verranno rimosse dalla coltura utilizzando il kit di rimozione delle cellule morte. La vitalità cellulare sarà valutata mediante esclusione del trypan blue.

Per valutare l'espressione superficiale dei marcatori macrofagici, i campioni di tessuto saranno colorati per citometria a flusso con anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromo contro CD14, CD68, CCR7 e CD80 per identificare M1, mentre anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromo contro CD14, CD68, CD163 e CD206 per identificare M2.

Analisi statistica: L'ipotesi di distribuzione normale per variabili continue sarà verificata mediante il test di Kolmogorov-Smirnov per la bontà dell'adattamento. Tutte le analisi inferenziali saranno eseguite utilizzando test statistici non parametrici. Le variabili non distribuite normalmente tra i gruppi saranno confrontate utilizzando il test di Kruskal-Wallis. L'intervallo di significatività statistica sarà P <.05. Inoltre, gli investigatori utilizzeranno test di confronto multipli post hoc rispetto ai controlli o rispetto a ciascuna fase per analizzare i dati.