维生素 A 与母婴流感疫苗反应

流感发病率影响整个人口并对经济负担和医疗保健系统产生巨大影响，特别是在 0-6 个月大的小婴儿中引起严重疾病。 最近的研究表明，在工业化国家这个年龄组的婴儿中流感发病率和住院率很高（Chiu 等人，2002 年；Poehling 等人，2006 年），流感相关的儿童死亡率在 6 个月以下的小婴儿中最高（ Bhat 等人，2005 年）。 不幸的是，灭活流感疫苗不推荐给这个年龄段的人群，但孕妇可以在第二至第三个三个月接种疫苗。 因此，婴儿被动免疫（来自母亲）的策略是对抗这种小婴儿感染的有效方法。 该方法自 1997 年在美国采用，并自 2005 年起被 WHO 推荐。

上呼吸道是病毒进入的门户和主要的复制位点（Gluck 等人，1994 年；Muszkat 等人，2000 年）。 因此，在病毒进入位点存在有效粘膜抗体对于中和病毒和预防感染至关重要（Meitin 等，1994）。 分泌型 IgA (sIgA) 是主要的粘膜抗体，约占人体总抗体产量的 70% (Brandtzaeg, 1994)。 sIgA 已被证明可介导鼻腔抗流感粘膜免疫（Renegar 和 Small，1991），因此表明在粘膜表面触发特异性抗体产生的疫苗接种策略的重要性以及膳食营养素触发粘膜神经肽释放的重要性维持粘膜免疫系统所必需的 (Renegar et al., 2001)。 许多临床试验检查了人体补充维生素 A 对粘膜免疫指标的影响。 根据乳果糖/甘露醇 (L/M) 尿液排泄试验的测量结果，对感染人类免疫缺陷病毒的孕妇补充营养与其婴儿在 14 周时的肠道通透性改善有关（Filteau 等人，1999）。 虽然在怀孕期间（Semba 等人，1999 年）或产后早期（Filteau 等人，2001 年）补充维生素 A 对母乳中的总 sIgA 没有影响，但牛奶中的维生素 A 已被证明可以抑制包膜病毒和非包膜病毒 (Clarke & May, 2000)。 然而，已检测到维生素 A 充足儿童的总 sIgA 水平明显高于维生素 A 缺乏儿童（Lin 等人，2007 年）。 在动物模型中，补充维生素 A 会增加粘膜中含有总和抗原特异性 sIgA 的细胞，从而提高存活率（Nikawa 等人，2001 年）。在婴儿早期，母乳是维生素 A 的主要来源，并且迄今为止，尚无研究调查产前补充维生素 A 和接种疫苗对后代疫苗特异性粘膜 sIgA 反应的影响。 虽然母体 IgA 不会经胎盘转移给婴儿，但由于母体补充维生素 A，母乳中维生素 A 和疫苗特异性 sIgA 的增加可能会增强婴儿的鼻腔 sIgA 反应，进而可能在小婴儿中提供更好的被动保护。

在我们最近的研究（Mother'SGift 项目，由 Thrasher 研究基金资助）中，我们发现母体接种流感疫苗可以显着减少孟加拉国 6 个月以下婴儿的流感疾病（Zaman 等人，2008 年）。 另一方面，孟加拉国和其他发展中国家孕妇维生素 A 缺乏症的患病率非常高。 孟加拉国一半以上的孕妇摄入的维生素 A 低于推荐的膳食允许量，并且维生素 A 状态低（血清视黄醇 <1•05 μmol/L），其中约五分之一被归类为缺乏（血清视黄醇 <0 •70 μmol/L)（Ahmed 等人，2003 年；Lee 等人，2008 年）。 尽管如此，有确凿的科学证据表明，临床和亚临床维生素 A 缺乏会损害先天免疫和适应性免疫的多个方面（Stephensen，2001 年）。 在另一项研究中，我们观察到原发性黄热病病毒疫苗特异性淋巴细胞胚细胞发生/抗体反应与体内维生素 A 储存之间存在显着正相关（Ahmad 等人，2008 年）。 因此，鉴于维生素 A 的潜在免疫调节作用，有必要研究母亲补充维生素 A 和接种流感疫苗是否可以作为公共卫生干预策略，以同时对抗母亲和年轻人的流感感染和维生素 A 缺乏症发展中国家的婴儿。

研究设计和方法：

研究地点：本研究将在 ICDDR,B 进行；达卡，孟加拉国。 将选择位于达卡市 Mirpur 地区的三个城市妇产科诊所，以接触在妊娠早期就诊且居住在附近社区的母亲。

研究对象：纳入标准是在妊娠中期开始时（即 约 12 周妊娠），愿意在怀孕期间留在达卡，并愿意在分娩时入住诊所。 胎龄将由自我报告的 LMP 确定，这在大多数情况下可能被低估。 在这项拟议的研究中，两周的变化是可以接受的。 排除标准是：全身性疾病史、既往复杂妊娠史或早产史、流产史、先天性异常、对流感疫苗过敏或接受过疫苗。

实验设计概述：这是一项安慰剂对照、双盲随机试验。 总体研究设计如图 1 所示，拟议协议相关活动的时间表和假设持续时间如表 1 所示。 为了允许样本收集、存储和化验与雇佣的现场服务员和可用的实验室设施的数量一起安排，我们计划在研究的前三个月每周让大约五名怀孕的母亲进入这项研究（表格1）。 将从母亲那里获得知情的书面同意。 六十六名孕妇将被随机分配接受每周 10,000 IU 维生素 A 或安慰剂（玉米油）胶囊，并收集血液用于血清维生素 A 评估。 随机化将由三个诊所使用平衡块设计进行分层。 这种每周补充将持续到产后 6 个月。 本研究中使用的补充维生素 A 剂量与其他研究中孕妇每周使用的剂量相似（Semba 等人，1999 年；Cox 等人，2006 年），并且证明是安全的。 现场工作人员将亲自将补充剂送到妈妈手中，并直接观察她们的消费情况。 在妊娠 26-28 周时，所有母亲都将接种灭活的三价流感病毒疫苗（GlaxoSmithKline；德国德累斯顿）。 世卫组织为北半球推荐的标准灭活三价流感 A/H3N2、A/H1N1 和 B 毒株将从该项目的商业来源获得。 研究医师将肌肉注射疫苗。 分娩时，将收集脐带血和初乳，分别用于评估流感特异性 IgG 和 sIgA 以及维生素 A 浓度。 还将记录新生儿的出生体重和身长。 在 6 个月大时，将收集母乳用于维生素 A 和流感病毒特异性 sIgA 评估，并采集婴儿（6 个月大）的静脉血（2-3 毫升）用于维生素 A 和流感病毒特异性 IgG 评估作为用于流感病毒特异性 sIgA 评估的婴儿洗鼻液。 我们拟议的研究不会妨碍现有的母亲产前护理，例如叶酸/铁补充剂或孟加拉国现有的婴儿疫苗接种计划。

随机化：每位母亲将获得一个随机生成的唯一标识号，该标识号将表明她被分配到的研究组。 相同的 ID 将标记在装有 60 粒胶囊的瓶子上。 现场服务员将使用这些胶囊进行每周补充，确保母亲的 ID 号和瓶子 ID 相同。 第三方（ACME 实验室，孟加拉国达卡）将准备和供应瓶装维生素 A 或安慰剂胶囊，并标有编号列表中的 ID 号。 负责人将保密至研究结束

样本采集：将采集母亲的外周血、脐带血、初乳、母乳、外周血和婴儿的鼻洗液，如图 1 所示。 鼻腔分泌物将通过将灯芯（棉花涂抹器）引入鼻孔并如前所述轻轻旋转 90 秒来获得（Wright 等人，1996）。 将灯芯提取到 1mL PBS 中，离心，收集上清液。 所有样品将被冷冻直到同时进行测试。

血清学评估：我们选择仅研究对一种流感抗原的体液免疫反应，因为这项拟议研究的目的是评估母体补充维生素 A 对婴儿被动抗体水平的影响，因此研究免疫反应是谨慎的做法对一种抗原。 将测试维生素 A 和甲型流感特异性体液免疫的以下参数。

维生素A评估：血浆、血清、初乳和母乳中的维生素A含量将通过LSD营养生化实验室的标准HPLC方法测量。

血凝抑制试验 [HAI]：HAI 抗体滴度将通过标准微量滴定测定法测量（Admon 等人，1997）。 将 12 个 HA 单位的选定甲型流感疫苗株添加到稀释的预处理血清中，用受体破坏酶（RDE，Sigma MO）和热灭活。 孵育后，将加入洗涤过的鸡红细胞，直至对照孔中发生沉淀。 HAI 滴度是显示完全 HAI 的血清最高稀释度的倒数。

流感特异性 IgG 和 sIgA ELISA：流感病毒血清/血浆中的特异性 IgG 和初乳、母乳和婴儿鼻拭子中的 sIgA 将通过 ELISA 进行分析，如前所述，稍作修改（Bruhl 等人，2000 年；Greenbaum 等人., 2004). 简而言之，免疫板将用获自 NIBSC 的纯化流感抗原以 2 ug/mL 在 40°C 下包被过夜。然后加入稀释的样品进行另一次过夜孵育。 HRP 缀合的抗人 IgG（BD-Pharmingen，CA）或小鼠抗 sIgA，过氧化物酶标记的（Alpco Diagnostics，NH）将用作缀合物。 为了构建标准曲线，将在每个 ELISA 板中引入分配有任意值的合并样品的连续稀释。 初乳、母乳和婴儿鼻拭子中的总 sIgA 也将通过 EIA 试剂盒（Alpco Diagnostics）确定，以调整甲型流感病毒特异性 sIgA 对总 sIgA 分泌的反应。