Vitamina A e resposta à vacina contra gripe materno-infantil

A morbidade da gripe afeta toda a população e tem um enorme impacto sobre a carga econômica e o sistema de saúde, causando doenças graves principalmente entre crianças de 0 a 6 meses de idade. Estudos recentes mostram altas taxas de influenza e hospitalização entre lactentes nessa faixa etária em países industrializados (Chiu et al., 2002; Poehling et al., 2006) e a mortalidade infantil relacionada à influenza é maior em lactentes antes dos 6 meses de idade ( Bhat e outros, 2005). Infelizmente, a vacina inativada contra influenza não é recomendada para essa faixa etária, mas mulheres grávidas podem ser vacinadas durante o 2º - 3º trimestre. Assim, a estratégia de imunização passiva (da mãe) dos lactentes é a forma eficaz de combater esta infecção entre os lactentes jovens. Essa abordagem é adotada nos EUA desde 1997 e recomendada pela OMS desde 2005.

O trato respiratório superior é a porta de entrada do vírus e o local primário de replicação (Gluck et al., 1994; Muszkat et al., 2000). Assim, a importância da presença de anticorpos mucosos eficazes no local de entrada do vírus é essencial para neutralizar o vírus e prevenir a infecção (Meitin et al., 1994). A IgA secretora (sIgA) é o anticorpo primário da mucosa, respondendo por aproximadamente 70% da produção total de anticorpos do corpo (Brandtzaeg, 1994). A sIgA demonstrou mediar a imunidade da mucosa nasal anti-influenza (Renegar & Small, 1991) e, portanto, indica a importância das estratégias de vacinação que desencadeiam a produção de anticorpos específicos nas superfícies das mucosas, bem como a importância dos nutrientes da dieta para desencadear a liberação de neuropeptídeos da mucosa necessária para a manutenção do sistema imunológico da mucosa (Renegar et al., 2001). Vários ensaios clínicos examinaram o efeito da suplementação de vitamina A em humanos nos indicadores de imunidade das mucosas. A suplementação para mulheres grávidas infectadas com o vírus da imunodeficiência humana está associada à permeabilidade intestinal melhorada em seus bebês em 14 semanas, conforme medido pelo teste de excreção urinária de lactulose/manitol (L/M) (Filteau et al., 1999). Embora a suplementação de vitamina A durante a gravidez (Semba et al., 1999) ou no início do período pós-parto (Filteau et al., 2001) não mostre efeito sobre a sIgA total no leite materno, a vitamina A no leite demonstrou inibir o crescimento de vírus envelopados e não envelopados (Clarke & May, 2000). No entanto, o nível total de sIgA de crianças com deficiência de vitamina A foi detectado significativamente mais alto do que o de crianças com deficiência de vitamina A (Lin et al., 2007). Em modelos animais, a suplementação de vitamina A aumenta as células contendo sIgA total e específica do antígeno na mucosa, o que, por sua vez, melhora a taxa de sobrevivência (Nikawa et al., 2001). até o momento, nenhum estudo investigou o efeito da suplementação pré-natal de vitamina A e da vacinação nas respostas de sIgA da mucosa específicas da vacina na prole. Embora a IgA materna não seja transferida por via transplacentária para os bebês, o aumento da vitamina A e da sIgA específica da vacina no leite materno como resultado da suplementação materna de vitamina A pode aumentar as respostas nasais de sIgA do bebê que, por sua vez, podem fornecer proteção passiva aprimorada entre bebês pequenos.

Em nosso estudo recente (Mother'SGift Project, financiado pelo Thrasher Research Fund), detectamos que a vacinação materna contra influenza pode reduzir substancialmente a doença influenza em bebês de até 6 meses de idade em Bangladesh (Zaman et al., 2008). Por outro lado, a prevalência de deficiência de vitamina A entre mulheres grávidas em Bangladesh, assim como em outros países em desenvolvimento, é muito alta. Mais da metade das mulheres grávidas em Bangladesh consomem menos vitamina A do que o recomendado na dieta e têm baixo nível de vitamina A (retinol sérico <1•05 μmol/L), com aproximadamente um quinto delas classificadas como deficientes (retinol sérico <0 •70 μmol/L) (Ahmed et al., 2003; Lee et al., 2008). No entanto, há evidências científicas conclusivas sugerindo que vários aspectos da imunidade inata e adaptativa estão comprometidos pela deficiência clínica e subclínica de vitamina A (Stephensen, 2001). Em outro estudo, observamos uma associação positiva significativa entre a blastogênese de linfócitos específicos da vacina primária contra a febre amarela / respostas de anticorpos e o estoque corporal de vitamina A (Ahmad et al., 2008). Assim, tendo em vista os potenciais papéis reguladores imunológicos da vitamina A, é de interesse investigar se a suplementação materna de vitamina A juntamente com a vacinação contra influenza poderia ser usada como estratégia de intervenção de saúde pública para combater simultaneamente a infecção por influenza e a deficiência de vitamina A entre mães e jovens bebês em países em desenvolvimento.

Projeto de Pesquisa e Métodos:

Local do estudo: Este estudo será realizado no ICDDR,B; Daca, Bangladesh. Três maternidades urbanas localizadas na área de Mirpur, na cidade de Dhaka, serão selecionadas para abordar as mães que visitam a clínica no primeiro trimestre e que residem na comunidade próxima.

Sujeito do estudo: O critério de inclusão é inscrever mães no início do segundo trimestre (ou seja, aproximadamente 12 semanas de gestação), disposta a permanecer em Dhaka durante a gravidez e admitida na clínica no momento do parto. A idade gestacional será determinada pela DUM autorrelatada, que provavelmente será subestimada na maioria dos casos. Uma variação de duas semanas será aceitável neste estudo proposto. Os critérios de exclusão são: história de doença sistêmica, gestações complicadas anteriores ou de parto prematuro, aborto, anomalia congênita e hipersensibilidade à vacina contra influenza ou recebimento da vacina.

Visão geral do projeto experimental: Este é um estudo randomizado, duplo-cego e controlado por placebo. O desenho geral do estudo é descrito na Figura 1, o cronograma e a duração hipotética das atividades relacionadas ao protocolo proposto são ilustradas na Tabela 1. Para permitir o agendamento da coleta, armazenamento e análise da amostra com o número de assistentes de campo contratados e instalações de laboratório que estarão disponíveis, planejamos inserir aproximadamente cinco mães grávidas por semana neste estudo no primeiro período de três meses do estudo ( Tabela 1). O consentimento informado por escrito será obtido das mães. Sessenta e seis mulheres grávidas serão randomizadas para receber cápsulas semanais de 10.000 UI de vitamina A ou placebo (óleo de milho) e o sangue será coletado para avaliação sérica de vitamina A. A randomização será estratificada por três clínicas usando delineamento de blocos balanceados. Esta suplementação semanal continuará até 6 meses após o parto. A dose de suplementação de vitamina A a ser utilizada neste estudo é semelhante às doses utilizadas semanalmente em gestantes em outros estudos (Semba et al., 1999; Cox et al., 2006) e se mostrou segura. Os trabalhadores de campo entregarão os suplementos às mães, pessoalmente, e observarão diretamente o seu consumo. Com 26-28 semanas de gestação, todas as mães receberão a vacina inativada contra o vírus influenza trivalente (GlaxoSmithKline; Dresden, Alemanha). As cepas padrão inativadas de influenza A/H3N2, A/H1N1 e B, conforme recomendado pela OMS para o Hemisfério Norte, serão obtidas de fontes comerciais para este projeto. O médico do estudo administrará a vacina por via intramuscular. No momento do parto, o sangue do cordão umbilical e o colostro serão coletados para avaliação específica de IgG e sIgA da Influenza, respectivamente, bem como concentração de vitamina A. O peso ao nascer e o comprimento dos bebês recém-nascidos também serão registrados. Aos 6 meses, o leite materno será coletado para avaliação de sIgA específica de vitamina A e vírus influenza e sangue venoso (2-3 ml) de bebês (6 meses de idade) será obtido para avaliação de IgG específica de vitamina A e vírus influenza também como lavagens nasais de bebês para avaliação de sIgA específica do vírus influenza. Nosso estudo proposto não prejudicará os cuidados pré-natais existentes para as mães, como a suplementação de folato/ferro ou o programa de vacinação infantil existente em Bangladesh.

Randomização: Cada mãe receberá um número de identificação exclusivo gerado aleatoriamente, que indicará o grupo de estudo ao qual ela foi designada. A mesma identificação será rotulada no frasco contendo 60 cápsulas. Os atendentes de campo usarão essas cápsulas para suplementação semanal, garantindo que o número de identificação da mãe e a identificação da mamadeira sejam os mesmos. Um terceiro (laboratórios ACME, Dhaka Bangladesh) preparará e fornecerá cápsulas de vitamina A ou placebo em frascos, rotulados com números de identificação de uma lista de números. O pessoal responsável irá mantê-lo confidencial até o final do estudo

Coleta de amostras: Sangue periférico da mãe, sangue do cordão umbilical, colostro, leite materno, sangue periférico e lavagens nasais de bebês serão coletados conforme descrito na Figura 1. A secreção nasal será obtida pela introdução de pavios (aplicadores de algodão) na narina e rotação suave por 90s conforme descrito anteriormente (Wright et al., 1996). As mechas serão extraídas em 1mL de PBS, centrifugadas e os sobrenadantes serão coletados. Todas as amostras serão congeladas até serem testadas simultaneamente.

Avaliação sorológica: Optamos por investigar as respostas imunes humorais apenas a um antígeno influenza porque o objetivo deste estudo proposto é avaliar o efeito da suplementação materna de vitamina A nos níveis de anticorpos passivos dos bebês, portanto, é prudente investigar as respostas imunes a um antígeno. Serão testados os seguintes parâmetros de vitamina A e imunidade humoral específica para Influenza A.

Avaliação de vitamina A: O teor de vitamina A no plasma, soro, colostro e leite materno será medido pelo método padrão de HPLC em vigor no Laboratório de Bioquímica Nutricional da LSD.

Teste de inibição da hemaglutinação [HAI]: os títulos de anticorpos HAI serão medidos por ensaio de microtitulação padrão (Admon et al., 1997). 12 unidades de HA da cepa de vacina Influenza A selecionada serão adicionadas a soros pré-tratados diluídos com enzima destruidora de receptores (RDE, Sigma MO) e inativação por calor. Após a incubação, serão adicionados eritrócitos de galinha lavados até que haja sedimentação nos poços de controle. O título de HAI é o inverso da maior diluição de soro exibindo HAI completo.

IgG e sIgA específicos para influenza: IgG específico para vírus influenza A no soro/plasma e sIgA no colostro, leite materno e zaragatoa nasal infantil serão analisados ​​por ELISA conforme descrito anteriormente com pequenas modificações (Bruhl et al., 2000; Greenbaum et al ., 2004). Resumidamente, as imunoplacas serão revestidas com antígeno de influenza purificado obtido de NIBSC a 2 ug/mL durante a noite a 40C. e então as amostras diluídas serão adicionadas para outra incubação durante a noite. IgG anti-humano conjugado com HRP (BD-Pharmingen, CA) ou anti-sIgA de camundongo, marcado com peroxidase (Alpco Diagnostics, NH) serão usados ​​como conjugados. Para construir a curva padrão, uma diluição em série de amostras reunidas com um valor arbitrário será introduzida em cada placa de ELISA. A sIgA total no colostro, leite materno e zaragatoa nasal infantil também será determinada pelo kit EIA (Alpco Diagnostics) para ajustar a resposta sIgA específica da influenza A em relação à secreção geral de sIgA.