Witamina A i odpowiedź na szczepionkę przeciw grypie matki i niemowlęcia

Zachorowalność na grypę dotyka całą populację i ma ogromny wpływ na obciążenia ekonomiczne i system opieki zdrowotnej, powodując szczególnie poważne choroby wśród niemowląt w wieku 0-6 miesięcy. Ostatnie badania wskazują na wysoki odsetek zachorowań na grypę i hospitalizacji wśród niemowląt w tej grupie wiekowej w krajach uprzemysłowionych (Chiu i in., 2002; Poehling i in., 2006), a śmiertelność dzieci związana z grypą jest najwyższa wśród niemowląt przed 6. miesiącem życia ( Bhat i in., 2005). Niestety inaktywowana szczepionka przeciw grypie nie jest zalecana dla tej grupy wiekowej, ale kobiety w ciąży mogą być szczepione w II-III trymestrze ciąży. Tak więc strategia biernej immunizacji (od matki) niemowląt jest skutecznym sposobem zwalczania tej infekcji wśród młodych niemowląt. Podejście to przyjęte w USA od 1997 roku i zalecane przez WHO od 2005 roku.

Górne drogi oddechowe są portalem wnikania wirusa i głównym miejscem replikacji (Gluck i in., 1994; Muszkat i in., 2000). Zatem znaczenie obecności skutecznych przeciwciał śluzówkowych w miejscu wniknięcia wirusa jest istotne dla zneutralizowania wirusa i zapobieżenia zakażeniu (Meitin i in., 1994). Wydzielnicza IgA (sIgA) jest głównym przeciwciałem śluzówkowym, odpowiadającym za około 70% całkowitej produkcji przeciwciał przez organizm (Brandtzaeg, 1994). Wykazano, że sIgA pośredniczy w odporności błony śluzowej nosa przeciw grypie (Renegar i Small, 1991) i dlatego wskazuje na znaczenie strategii szczepień, które wyzwalają wytwarzanie specyficznych przeciwciał na powierzchniach błony śluzowej, jak również na znaczenie składników odżywczych w diecie dla wyzwalania uwalniania neuropeptydów błony śluzowej niezbędne do utrzymania śluzówkowego układu odpornościowego (Renegar i in., 2001). Szereg badań klinicznych dotyczyło wpływu suplementacji witaminy A u ludzi na wskaźniki odporności błony śluzowej. Suplementacja kobiet ciężarnych zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności jest związana z poprawą przepuszczalności jelit u ich niemowląt w wieku 14 tygodni, co zmierzono za pomocą testu wydalania z moczem laktulozy/mannitolu (L/M) (Filteau i in., 1999). Podczas gdy suplementacja witaminy A w czasie ciąży (Semba i wsp., 1999) lub we wczesnym okresie poporodowym (Filteau i wsp., 2001) nie wykazuje wpływu na całkowite stężenie sIgA w mleku matki, wykazano raczej, że witamina A w mleku hamuje wzrost zarówno wirusy otoczkowe, jak i bezotoczkowe (Clarke i May, 2000). Jednak całkowity poziom sIgA u dzieci z wystarczającą ilością witaminy A został wykryty znacznie wyższy niż u dzieci z niedoborem witaminy A (Lin i in., 2007). W modelu zwierzęcym suplementacja witaminą A zwiększa zarówno całkowitą, jak i specyficzną dla antygenu liczbę komórek zawierających sIgA w błonie śluzowej, co z kolei poprawia wskaźnik przeżywalności (Nikawa i in., 2001). We wczesnym okresie niemowlęcym głównym źródłem witaminy A jest mleko matki i data brak badań oceniających wpływ prenatalnej suplementacji witaminy A i szczepienia na specyficzną dla szczepionki odpowiedź śluzówkową sIgA u potomstwa. Chociaż matczyna IgA nie jest przenoszona przez łożysko na niemowlęta, to zwiększone stężenie witaminy A i sIgA swoistej dla szczepionki w mleku matki w wyniku suplementacji witaminy A przez matkę może nasilać nosowe odpowiedzi sIgA niemowlęcia, co z kolei może zapewnić lepszą ochronę bierną u młodych niemowląt.

W naszym niedawnym badaniu (Projekt Mother'SGift, finansowany przez Thrasher Research Fund) wykryliśmy, że szczepienie matki przeciwko grypie może znacznie zmniejszyć zachorowania na grypę u małych niemowląt w wieku do 6 miesięcy w Bangladeszu (Zaman i in., 2008). Z drugiej strony częstość występowania niedoboru witaminy A wśród kobiet w ciąży w Bangladeszu, jak również w innych krajach rozwijających się, jest bardzo wysoka. Ponad połowa ciężarnych kobiet w Bangladeszu spożywa mniej witaminy A niż zalecana dieta i ma niski poziom witaminy A (retinol w surowicy <1•05 μmol/l), a około jedna piąta z nich jest sklasyfikowana jako niedoborowa (retinol w surowicy <0 •70 μmol/l) (Ahmed i in., 2003; Lee i in., 2008). Niemniej jednak istnieją rozstrzygające dowody naukowe sugerujące, że kliniczny i subkliniczny niedobór witaminy A upośledza kilka aspektów zarówno odporności wrodzonej, jak i nabytej (Stephensen, 2001). W innym badaniu zaobserwowaliśmy znaczący pozytywny związek między blastogenezą limfocytów/reakcją przeciwciał swoistą dla pierwotnej szczepionki przeciwko wirusowi żółtej febry a magazynowaniem witaminy A w organizmie (Ahmad i in., 2008). Tak więc, biorąc pod uwagę potencjalną immunoregulacyjną rolę witaminy A, interesujące jest zbadanie, czy suplementacja matczynej witaminy A wraz ze szczepieniem przeciw grypie może być wykorzystana jako strategia interwencji zdrowia publicznego w celu zwalczania zarówno zakażenia grypą, jak i niedoboru witaminy A jednocześnie wśród matek i młodych niemowląt w krajach rozwijających się.

Projekt badawczy i metody:

Miejsce badania: To badanie zostanie przeprowadzone w ICDDR,B; Dhaka, Bangladesz. Trzy miejskie kliniki położnicze zlokalizowane w rejonie Mirpur w mieście Dhaka zostaną wybrane dla zbliżających się matek, które odwiedzają klinikę w pierwszym trymestrze ciąży i które są rezydentami pobliskiej społeczności.

Temat badania: Kryterium włączenia jest rejestracja matek na początku drugiego trymestru (tj. około 12 tygodnia ciąży), chętna do pozostania w Dhace w czasie ciąży i chętna do przyjęcia do kliniki przy porodzie. Wiek ciążowy zostanie określony na podstawie samozgłoszonego LMP, który w większości przypadków jest prawdopodobnie niedoszacowany. Dwutygodniowa zmiana będzie akceptowalna w tym proponowanym badaniu. Kryteriami wykluczającymi są: historia chorób ogólnoustrojowych, wcześniejsze ciąże powikłane lub poród przedwczesny, poronienie, wada wrodzona oraz nadwrażliwość na szczepionkę przeciw grypie lub otrzymanie szczepionki.

Przegląd projektu eksperymentu: Jest to kontrolowane placebo, podwójnie zaślepione i randomizowane badanie. Ogólny projekt badania przedstawiono na rycinie 1, harmonogram i hipotetyczny czas trwania proponowanych działań związanych z protokołem przedstawiono w tabeli 1. Aby umożliwić zaplanowanie pobierania, przechowywania i analizy próbek z liczbą zatrudnionych pracowników terenowych i dostępnych urządzeń laboratoryjnych, planujemy wprowadzić do tego badania około pięciu ciężarnych matek tygodniowo w pierwszym trzymiesięcznym okresie badania ( Tabela 1). Świadoma pisemna zgoda zostanie uzyskana od matek. Sześćdziesiąt sześć kobiet w ciąży zostanie losowo przydzielonych do grup otrzymujących co tydzień kapsułki 10 000 IU witaminy A lub placebo (olej kukurydziany), a krew zostanie pobrana do oceny poziomu witaminy A w surowicy. Randomizacja zostanie podzielona na warstwy przez trzy kliniki przy użyciu zrównoważonego projektu blokowego. Ta cotygodniowa suplementacja będzie kontynuowana do 6 miesięcy po porodzie. Uzupełniająca dawka witaminy A stosowana w tym badaniu jest podobna do dawek stosowanych co tydzień wśród kobiet w ciąży w innych badaniach (Semba i in., 1999; Cox i in., 2006) i wykazano, że jest bezpieczna. Pracownicy terenowi będą osobiście dostarczać suplementy matkom i bezpośrednio obserwować ich spożycie. W 26-28 tygodniu ciąży wszystkie matki otrzymają inaktywowaną, trójwalentną szczepionkę przeciw wirusowi grypy (GlaxoSmithKline; Drezno, Niemcy). Standardowe inaktywowane trójwartościowe szczepy grypy A/H3N2, A/H1N1 i B, zgodnie z zaleceniami WHO dla półkuli północnej, zostaną pozyskane ze źródeł komercyjnych na potrzeby tego projektu. Lekarz prowadzący badanie poda szczepionkę domięśniowo. Podczas porodu zostanie pobrana krew pępowinowa i siara w celu oznaczenia odpowiednio IgG i sIgA specyficznych dla wirusa grypy, a także stężenia witaminy A. Rejestrowana będzie również masa urodzeniowa i długość noworodków. W wieku 6 miesięcy zostanie pobrane mleko matki w celu oznaczenia sIgA swoistej dla witaminy A i wirusa grypy oraz pobrana zostanie krew żylna (2-3 ml) od niemowląt (w wieku 6 miesięcy) w celu oznaczenia sIgG swoistej dla witaminy A i wirusa grypy jako popłuczyny z nosa niemowląt do oceny swoistej dla wirusa grypy sIgA. Nasze proponowane badanie nie będzie utrudniać istniejącej opieki prenatalnej dla matek, takiej jak suplementacja kwasu foliowego / żelaza lub istniejący program szczepień niemowląt w Bangladeszu.

Randomizacja: Każda matka otrzyma unikalny, losowo wygenerowany numer identyfikacyjny, który wskaże, do której grupy badawczej została przydzielona. Ten sam identyfikator będzie umieszczony na butelce zawierającej 60 kapsułek. Pracownicy terenowi będą używać tych kapsułek do cotygodniowej suplementacji, upewniając się, że numer identyfikacyjny matki i identyfikator butelki są takie same. Strona trzecia (laboratoria ACME, Dhaka Bangladesz) przygotuje i dostarczy kapsułki witaminy A lub placebo w butelkach oznaczonych numerami identyfikacyjnymi z listy numerów. Odpowiedzialny personel zachowa to w tajemnicy do końca studiów

Pobieranie próbek: Krew obwodowa od matki, krew pępowinowa, siara, mleko matki, krew obwodowa i popłuczyny z nosa od niemowląt zostaną pobrane w sposób opisany na rycinie 1. Wydzielinę z nosa uzyskuje się przez wprowadzenie knotów (aplikatorów bawełnianych) do nozdrza i delikatne obracanie przez 90 sekund, jak opisano wcześniej (Wright i in., 1996). Knoty zostaną wyekstrahowane do 1 ml PBS, odwirowane i zebrane zostaną supernatanty. Wszystkie próbki zostaną zamrożone do czasu równoczesnego przetestowania.

Ocena serologiczna: Zdecydowaliśmy się zbadać humoralne odpowiedzi immunologiczne tylko na jeden antygen grypy, ponieważ celem tego proponowanego badania jest ocena wpływu suplementacji matczynej witaminy A na poziom pasywnych przeciwciał niemowląt, dlatego rozważne jest zbadanie odpowiedzi immunologicznych do jednego antygenu. Zbadane zostaną następujące parametry witaminy A i swoistej odporności humoralnej grypy A.

Ocena witaminy A: Zawartość witaminy A w osoczu, surowicy, siarze i mleku matki będzie mierzona standardową metodą HPLC stosowaną w Laboratorium Biochemii Żywienia LSD.

Test hamowania hemaglutynacji [HAI]: Miana przeciwciał przeciwko HAI będą mierzone standardowym testem mikromiareczkowania (Admon i wsp., 1997). 12 jednostek HA wybranego szczepu szczepionki przeciw grypie A zostanie dodanych do rozcieńczonych surowic poddanych wstępnej obróbce enzymem niszczącym receptory (RDE, Sigma MO) i inaktywacji termicznej. Po inkubacji dodaje się przemyte erytrocyty kurczaka, aż w dołkach kontrolnych nastąpi sedymentacja. Miano HAI jest odwrotnością najwyższego rozcieńczenia surowicy wykazującej całkowity HAI.

Swoiste dla grypy IgG i sIgA ELISA: Wirus grypy Swoiste IgG w surowicy/osoczu i sIgA w siarze, mleku matki i wymazie z nosa niemowlęcia będą analizowane za pomocą testu ELISA, jak opisano wcześniej z niewielkimi modyfikacjami (Bruhl i in., 2000; Greenbaum i in. ., 2004). W skrócie płytki do immunooznaczeń będą powlekane oczyszczonym antygenem grypy uzyskanym z NIBSC w stężeniu 2 ug/ml przez noc w temperaturze 40°C. a następnie rozcieńczone próbki zostaną dodane do kolejnej całonocnej inkubacji. Jako koniugaty zostaną użyte skoniugowane z HRP anty-ludzkie IgG (BD-Pharmingen, CA) lub mysie anty-sIgA, znakowane peroksydazą (Alpco Diagnostics, NH). Aby skonstruować krzywą wzorcową, na każdej płytce ELISA zostanie wprowadzone seryjne rozcieńczenie połączonych próbek, którym przypisano dowolną wartość. Całkowite stężenie sIgA w siarze, mleku kobiecym i wymazie z nosa niemowlęcia zostanie również określone za pomocą zestawu EIA (Alpco Diagnostics) w celu dostosowania swoistej odpowiedzi sIgA wirusa grypy w odniesieniu do całkowitego wydzielania sIgA.