Vitamin A und die Impfreaktion gegen die Mutter-Kind-Grippe

Die Influenza-Morbidität betrifft die gesamte Bevölkerung und hat enorme Auswirkungen auf die wirtschaftliche Belastung und das Gesundheitssystem und führt insbesondere bei Kleinkindern im Alter von 0 bis 6 Monaten zu schweren Erkrankungen. Jüngste Studien zeigen eine hohe Rate an Influenza-Erkrankungen und Krankenhausaufenthalten bei Säuglingen dieser Altersgruppe in Industrieländern (Chiu et al., 2002; Poehling et al., 2006) und die grippebedingte Kindersterblichkeit ist bei Kleinkindern vor dem 6. Lebensmonat am höchsten ( Bhat et al., 2005). Leider wird der inaktivierte Grippeimpfstoff für diese Altersgruppe nicht empfohlen, schwangere Frauen können jedoch im 2. bis 3. Trimester geimpft werden. Daher ist die Strategie der passiven Immunisierung (durch die Mutter) von Säuglingen der wirksame Weg, diese Infektion bei Kleinkindern zu bekämpfen. Dieser Ansatz wird in den USA seit 1997 angewendet und seit 2005 von der WHO empfohlen.

Die oberen Atemwege sind die Eintrittspforte des Virus und der primäre Ort der Replikation (Gluck et al., 1994; Muszkat et al., 2000). Daher ist das Vorhandensein wirksamer Schleimhautantikörper an der Eintrittsstelle des Virus von entscheidender Bedeutung, um das Virus zu neutralisieren und eine Infektion zu verhindern (Meitin et al., 1994). Sekretorisches IgA (sIgA) ist der primäre Schleimhautantikörper und macht etwa 70 % der gesamten Antikörperproduktion des Körpers aus (Brandtzaeg, 1994). Es wurde gezeigt, dass sIgA die nasale Anti-Influenza-Schleimhautimmunität vermittelt (Renegar & Small, 1991) und weist daher auf die Bedeutung von Impfstrategien hin, die die spezifische Antikörperproduktion an Schleimhautoberflächen auslösen, sowie auf die Bedeutung von Nahrungsnährstoffen für die Auslösung der Freisetzung von Schleimhautneuropeptiden notwendig für die Aufrechterhaltung des mukosalen Immunsystems (Renegar et al., 2001). In einer Reihe klinischer Studien wurde die Wirkung einer Vitamin-A-Supplementierung beim Menschen auf Indikatoren der Schleimhautimmunität untersucht. Die Ergänzung mit mit dem humanen Immundefizienzvirus infizierten schwangeren Frauen ist mit einer verbesserten Darmpermeabilität ihrer Säuglinge in der 14. Woche verbunden, gemessen durch einen Lactulose/Mannitol (L/M)-Urinausscheidungstest (Filteau et al., 1999). Während eine Vitamin-A-Supplementierung während der Schwangerschaft (Semba et al., 1999) oder in der frühen postpartalen Phase (Filteau et al., 2001) keinen Einfluss auf das Gesamt-sIgA in der Muttermilch zeigt, wurde gezeigt, dass Vitamin A in der Milch vielmehr das Wachstum von sIgA hemmt sowohl umhüllte als auch unbehüllte Viren (Clarke & May, 2000). Es wurde jedoch festgestellt, dass der Gesamt-sIgA-Spiegel bei Kindern mit Vitamin-A-Mangel deutlich höher ist als bei Kindern mit Vitamin-A-Mangel (Lin et al., 2007). Im Tiermodell erhöht die Vitamin-A-Supplementierung sowohl die Gesamtzahl als auch die Antigen-spezifischen sIgA-haltigen Zellen in der Schleimhaut, was wiederum die Überlebensrate verbessert (Nikawa et al., 2001). Im frühen Säuglingsalter ist Muttermilch die vorherrschende Quelle für Vitamin A und Vitamin A Datum: Keine Studie untersucht die Wirkung einer vorgeburtlichen Vitamin-A-Supplementierung und Impfung auf die impfstoffspezifischen mukosalen sIgA-Reaktionen bei Nachkommen. Obwohl mütterliches IgA nicht transplazentar auf die Säuglinge übertragen wird, kann ein erhöhter Vitamin-A- und impfstoffspezifischer sIgA-Gehalt in der Muttermilch als Folge einer mütterlichen Vitamin-A-Supplementierung die nasalen sIgA-Reaktionen des Säuglings verstärken, was wiederum zu einem verbesserten passiven Schutz bei jungen Säuglingen führen kann.

In unserer aktuellen Studie (Mother'SGift Project, finanziert vom Thrasher Research Fund) haben wir festgestellt, dass die Grippeimpfung von Müttern die Grippeerkrankung bei Kleinkindern bis zu einem Alter von 6 Monaten in Bangladesch erheblich reduzieren kann (Zaman et al., 2008). Andererseits ist die Prävalenz eines Vitamin-A-Mangels bei schwangeren Frauen in Bangladesch und anderen Entwicklungsländern sehr hoch. Mehr als die Hälfte der schwangeren Frauen in Bangladesch verbrauchen weniger Vitamin A als die empfohlene Nahrungsdosis und haben einen niedrigen Vitamin-A-Status (Serum-Retinol <1,05 μmol/L), wobei etwa ein Fünftel von ihnen als mangelhaft eingestuft wird (Serum-Retinol <0,5 µmol/L). •70 μmol/L) (Ahmed et al., 2003; Lee et al., 2008). Dennoch gibt es schlüssige wissenschaftliche Beweise dafür, dass mehrere Aspekte sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Immunität durch klinischen und subklinischen Vitamin-A-Mangel beeinträchtigt werden (Stephensen, 2001). In einer anderen Studie beobachteten wir einen signifikanten positiven Zusammenhang zwischen der spezifischen Lymphozyten-Blastogenese/Antikörperreaktionen des primären Gelbfieber-Virusimpfstoffs und dem Vitamin-A-Speicher im Körper (Ahmad et al., 2008). Angesichts der potenziellen immunregulatorischen Rolle von Vitamin A ist es daher von Interesse zu untersuchen, ob eine Vitamin-A-Supplementierung der Mutter zusammen mit einer Grippeimpfung als Interventionsstrategie für die öffentliche Gesundheit eingesetzt werden könnte, um sowohl Grippeinfektionen als auch Vitamin-A-Mangel gleichzeitig bei Müttern und Kindern zu bekämpfen Säuglinge in Entwicklungsländern.

Forschungsdesign und Methoden:

Studienort: Diese Studie wird am ICDDR,B durchgeführt; Dhaka, Bangladesch. Drei städtische Entbindungskliniken im Stadtteil Mirpur der Stadt Dhaka werden für die Kontaktaufnahme mit Müttern ausgewählt, die die Klinik im ersten Trimester besuchen und in der nahegelegenen Gemeinde wohnen.

Studienfach: Das Einschlusskriterium besteht darin, Mütter zu Beginn des zweiten Trimesters (d. h. (ca. 12 Schwangerschaftswochen), bereit, während der Schwangerschaft in Dhaka zu bleiben und bei der Entbindung in die Klinik aufgenommen zu werden. Das Gestationsalter wird durch den selbst gemeldeten LMP bestimmt, der in den meisten Fällen wahrscheinlich unterschätzt wird. Eine zweiwöchige Variation wird in dieser vorgeschlagenen Studie akzeptabel sein. Die Ausschlusskriterien sind: Vorgeschichte einer systemischen Erkrankung, frühere komplizierte Schwangerschaften oder Frühgeburten, Abtreibung, angeborene Anomalie und Überempfindlichkeit gegen Influenza-Impfstoff oder Erhalt des Impfstoffs.

Überblick über das Versuchsdesign: Dies ist eine placebokontrollierte, doppelblinde und randomisierte Studie. Das gesamte Studiendesign ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Zeitplan und die hypothetische Dauer der vorgeschlagenen protokollbezogenen Aktivitäten sind in Tabelle 1 dargestellt. Um eine Planung der Probenentnahme, -lagerung und -analyse mit der Anzahl der verfügbaren Außendienstmitarbeiter und Laboreinrichtungen zu ermöglichen, planen wir, im ersten dreimonatigen Zeitraum der Studie etwa fünf schwangere Mütter pro Woche in diese Studie aufzunehmen ( Tabelle 1). Eine informierte schriftliche Einwilligung wird von den Müttern eingeholt. 66 schwangere Frauen werden randomisiert und erhalten entweder wöchentlich 10.000 IE Vitamin A oder Placebo-Kapseln (Maisöl), und es wird Blut für die Serum-Vitamin-A-Bestimmung entnommen. Die Randomisierung wird anhand eines ausgewogenen Blockdesigns nach drei Kliniken geschichtet. Diese wöchentliche Nahrungsergänzung wird bis 6 Monate nach der Geburt fortgesetzt. Die in dieser Studie zu verwendende ergänzende Vitamin-A-Dosis ähnelt den Dosen, die in anderen Studien wöchentlich bei schwangeren Frauen angewendet wurden (Semba et al., 1999; Cox et al., 2006) und hat sich als sicher erwiesen. Außendienstmitarbeiter liefern die Nahrungsergänzungsmittel persönlich an die Mütter und beobachten deren Verzehr direkt. In der 26. bis 28. Schwangerschaftswoche erhalten alle Mütter einen inaktivierten, trivalenten Influenzavirus-Impfstoff (GlaxoSmithKline; Dresden, Deutschland). Für dieses Projekt werden standardmäßig inaktivierte trivalente Influenzastämme A/H3N2, A/H1N1 und B, wie von der WHO für die nördliche Hemisphäre empfohlen, aus kommerziellen Quellen bezogen. Der Studienarzt wird den Impfstoff intramuskulär verabreichen. Bei der Entbindung werden Nabelschnurblut und Kolostrum für die Influenza-spezifische IgG- bzw. sIgA-Beurteilung sowie die Vitamin-A-Konzentration entnommen. Auch Geburtsgewicht und Länge der Neugeborenen werden erfasst. Nach 6 Monaten wird Muttermilch für die Vitamin-A- und Influenzavirus-spezifische sIgA-Beurteilung entnommen und venöses Blut (2–3 ml) von Säuglingen (im Alter von 6 Monaten) wird ebenfalls für die Vitamin-A- und Influenzavirus-spezifische IgG-Beurteilung entnommen als Nasenspülungen bei Säuglingen zur Influenzavirus-spezifischen sIgA-Beurteilung. Unsere vorgeschlagene Studie wird die bestehende Schwangerschaftsvorsorge für Mütter wie Folat-/Eisenergänzung oder das bestehende Impfprogramm für Säuglinge in Bangladesch nicht beeinträchtigen.

Randomisierung: Jede Mutter erhält eine eindeutige, zufällig generierte Identifikationsnummer, die die Studiengruppe angibt, der sie zugeordnet ist. Die gleiche ID wird auf der Flasche mit 60 Kapseln angebracht. Außendienstmitarbeiter verwenden diese Kapseln zur wöchentlichen Nahrungsergänzung und achten dabei darauf, dass die ID-Nummer der Mutter und die Flaschen-ID identisch sind. Ein Dritter (ACME Laboratories, Dhaka, Bangladesch) wird Vitamin-A- oder Placebo-Kapseln in Flaschen vorbereiten und liefern, die mit ID-Nummern aus einer Nummernliste gekennzeichnet sind. Das verantwortliche Personal wird die Daten bis zum Ende des Studiums vertraulich behandeln

Probenentnahme: Peripheres Blut der Mutter, Nabelschnurblut, Kolostrum, Muttermilch, peripheres Blut und Nasenspülungen von Säuglingen werden wie in Abbildung 1 beschrieben entnommen. Nasensekret wird gewonnen, indem Dochte (Watteapplikatoren) in das Nasenloch eingeführt und 90 Sekunden lang sanft rotiert werden, wie zuvor beschrieben (Wright et al., 1996). Die Dochte werden in 1 ml PBS extrahiert, zentrifugiert und die Überstände gesammelt. Alle Proben werden eingefroren, bis sie gleichzeitig getestet werden.

Serologische Bewertung: Wir haben uns entschieden, die humoralen Immunantworten nur auf ein Influenza-Antigen zu untersuchen, da der Zweck dieser vorgeschlagenen Studie darin besteht, die Wirkung einer mütterlichen Vitamin-A-Supplementierung auf die passiven Antikörperspiegel der Säuglinge zu bewerten. Daher ist es ratsam, Immunantworten zu untersuchen zu einem Antigen. Die folgenden Parameter der spezifischen humoralen Immunität gegen Vitamin A und Influenza A werden getestet.

Vitamin-A-Beurteilung: Der Vitamin-A-Gehalt in Plasma, Serum, Kolostrum und Muttermilch wird mit der Standard-HPLC-Methode gemessen, die im Nutritional Biochemistry Lab von LSD vorhanden ist.

Hämagglutinationshemmungstest [HAI]: HAI-Antikörpertiter werden durch einen Standard-Mikrotitertest gemessen (Admon et al., 1997). 12 HA-Einheiten des ausgewählten Influenza-A-Impfstoffstamms werden verdünnten, vorbehandelten Seren mit rezeptorzerstörendem Enzym (RDE, Sigma MO) und Hitzeinaktivierung zugesetzt. Nach der Inkubation werden gewaschene Hühnererythrozyten zugegeben, bis in den Kontrollvertiefungen eine Sedimentation eintritt. Der HAI-Titer ist der Kehrwert der höchsten Serumverdünnung, die einen vollständigen HAI aufweist.

Influenza-spezifisches IgG und sIgA ELISA: Influenzavirus Ein spezifisches IgG in Serum/Plasma und sIgA in Kolostrum, Muttermilch und Nasenabstrich von Säuglingen werden durch ELISA wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen analysiert (Bruhl et al., 2000; Greenbaum et al ., 2004). Kurz gesagt, Immunoplatten werden über Nacht bei 40 °C mit gereinigtem Influenza-Antigen von NIBSC in einer Konzentration von 2 μg/ml beschichtet. Anschließend werden verdünnte Proben für eine weitere Inkubation über Nacht hinzugefügt. Als Konjugate werden HRP-konjugiertes Anti-Human-IgG (BD-Pharmingen, CA) oder Maus-Anti-sIgA, Peroxidase-markiert (Alpco Diagnostics, NH) verwendet. Um eine Standardkurve zu erstellen, wird in jede ELISA-Platte eine Reihenverdünnung gepoolter Proben gegeben, denen ein willkürlicher Wert zugewiesen wird. Das Gesamt-sIgA in Kolostrum, Muttermilch und Nasenabstrichen von Säuglingen wird ebenfalls mit dem EIA-Kit (Alpco Diagnostics) bestimmt, um die Influenza-A-spezifische sIgA-Reaktion im Hinblick auf die gesamte sIgA-Sekretion anzupassen.