Vitamina A e risposta al vaccino antinfluenzale materno-infantile

La morbilità dell'influenza colpisce l'intera popolazione e ha un impatto enorme sull'onere economico e sul sistema sanitario, causando in particolare gravi malattie tra i bambini di età compresa tra 0 e 6 mesi. Studi recenti mostrano alti tassi di malattia influenzale e ospedalizzazione tra i bambini di questa fascia di età nei paesi industrializzati (Chiu et al., 2002; Poehling et al., 2006) e la mortalità infantile correlata all'influenza è più alta nei bambini prima dei 6 mesi di età ( Bhat et al., 2005). Sfortunatamente, il vaccino antinfluenzale inattivato non è raccomandato per questa fascia di età, ma le donne in gravidanza possono essere vaccinate durante il 2° e il 3° trimestre. Quindi la strategia dell'immunizzazione passiva (da parte della madre) dei bambini è il modo efficace per combattere questa infezione tra i bambini piccoli. Questo approccio adottato negli Stati Uniti dal 1997 e raccomandato dall'OMS dal 2005.

Il tratto respiratorio superiore è il portale di ingresso del virus e il sito primario di replicazione (Gluck et al., 1994; Muszkat et al., 2000). Pertanto l'importanza della presenza di efficaci anticorpi della mucosa nel sito di ingresso del virus è essenziale per neutralizzare il virus e prevenire l'infezione (Meitin et al., 1994). L'IgA secretoria (sIgA) è l'anticorpo primario della mucosa, che rappresenta circa il 70% della produzione totale di anticorpi del corpo (Brandtzaeg, 1994). sIgA ha dimostrato di mediare l'immunità della mucosa nasale anti-influenzale (Renegar & Small, 1991) e quindi indica l'importanza delle strategie di vaccinazione che attivano la produzione di anticorpi specifici sulle superfici della mucosa, nonché l'importanza dei nutrienti alimentari per innescare il rilascio di neuropeptidi della mucosa necessario per il mantenimento del sistema immunitario della mucosa (Renegar et al., 2001). Numerosi studi clinici hanno esaminato l'effetto dell'integrazione di vitamina A negli esseri umani sugli indicatori dell'immunità della mucosa. L'integrazione di donne gravide infette da virus dell'immunodeficienza umana è associata a una migliore permeabilità intestinale nei loro bambini a 14 settimane, come misurato dal test di escrezione urinaria di lattulosio/mannitolo (L/M) (Filteau et al., 1999). Mentre l'integrazione di vitamina A durante la gravidanza (Semba et al., 1999) o nel primo periodo postpartum (Filteau et al., 2001) non mostra alcun effetto sulle sIgA totali nel latte materno, è stato invece dimostrato che la vitamina A nel latte inibisce la crescita di sia virus avvolti che non avvolti (Clarke & May, 2000). Tuttavia, il livello totale di sIgA dei bambini con sufficiente vitamina A è stato rilevato significativamente più alto di quello dei bambini con carenza di vitamina A (Lin et al., 2007). Nel modello animale, l'integrazione di vitamina A aumenta le cellule contenenti sIgA totali e antigene specifiche nella mucosa, il che a sua volta migliora il tasso di sopravvivenza (Nikawa et al., 2001) Durante la prima infanzia il latte materno è la fonte predominante di vitamina A e per Ad oggi nessuno studio indaga l'effetto dell'integrazione prenatale di vitamina A e della vaccinazione sulle risposte sIgA mucose specifiche del vaccino nella prole. Sebbene le IgA materne non vengano trasferite ai neonati per via transplacentare, l'aumento di vitamina A e di sIgA specifiche per il vaccino nel latte materno come risultato dell'integrazione materna di vitamina A può aumentare le risposte nasali di sIgA del bambino che a sua volta può fornire una migliore protezione passiva tra i bambini piccoli.

Nel nostro recente studio (Mother'SGift Project, finanziato dal Thrasher Research Fund), abbiamo rilevato che la vaccinazione contro l'influenza materna può ridurre sostanzialmente la malattia influenzale nei bambini fino a 6 mesi di età in Bangladesh (Zaman et al., 2008). D'altra parte la prevalenza della carenza di vitamina A tra le donne incinte in Bangladesh così come in altri paesi in via di sviluppo è molto alta. Più della metà delle donne incinte in Bangladesh consumano meno vitamina A rispetto alla dose dietetica raccomandata e hanno uno stato basso di vitamina A (retinolo sierico <1•05 μmol/L) con circa un quinto di loro classificato come carente (retinolo sierico <0 •70 μmol/L) (Ahmed et al., 2003; Lee et al., 2008). Tuttavia, esistono prove scientifiche conclusive che suggeriscono che diversi aspetti dell'immunità innata e adattativa sono compromessi dalla carenza clinica e subclinica di vitamina A (Stephensen, 2001). In un altro studio, abbiamo osservato una significativa associazione positiva tra la blastogenesi linfocitaria specifica del vaccino virale primario contro la febbre gialla/risposte anticorpali e il deposito di vitamina A nel corpo (Ahmad et al., 2008). Pertanto, in considerazione dei potenziali ruoli di regolazione immunitaria della vitamina A, è interessante indagare se l'integrazione materna di vitamina A insieme alla vaccinazione antinfluenzale possa essere utilizzata come strategia di intervento di sanità pubblica per combattere simultaneamente sia l'infezione influenzale che la carenza di vitamina A tra le madri e i giovani bambini nei paesi in via di sviluppo.

Disegno e metodi della ricerca:

Sede dello studio: questo studio sarà condotto presso l'ICDDR,B; Dacca, Bangladesh. Saranno selezionate tre cliniche di maternità urbane situate nell'area di Mirpur della città di Dhaka per le madri in avvicinamento che visitano la clinica nel primo trimestre e che sono la residenza della comunità vicina.

Oggetto dello studio: il criterio di inclusione è quello di iscrivere le madri all'inizio del secondo trimestre (es. circa 12 settimane di gestazione), disposta a rimanere a Dhaka durante la gravidanza e disposta a ricoverarsi in clinica al momento del parto. L'età gestazionale sarà determinata dal LMP auto-riferito, che è probabilmente sottostimato nella maggior parte dei casi. Una variazione di due settimane sarà accettabile in questo studio proposto. I criteri di esclusione sono: anamnesi di malattia sistemica, precedenti gravidanze complicate o di parto prematuro, aborto, anomalia congenita e ipersensibilità al vaccino antinfluenzale o al ricevimento del vaccino.

Panoramica del disegno sperimentale: si tratta di uno studio controllato con placebo, in doppio cieco e randomizzato. Il disegno complessivo dello studio è delineato nella Figura 1, la sequenza temporale e la durata ipotetica delle attività relative al protocollo proposte sono illustrate nella Tabella 1. Per consentire la programmazione della raccolta, della conservazione e dell'analisi del campione con il numero di assistenti sul campo assunti e strutture di laboratorio che saranno disponibili, prevediamo di inserire in questo studio circa cinque madri incinte alla settimana nel primo periodo di tre mesi dello studio ( Tabella 1). Il consenso informato scritto sarà ottenuto dalle madri. Sessantasei donne incinte saranno randomizzate per ricevere 10.000 UI settimanali di vitamina A o capsule di placebo (olio di mais) e il sangue sarà raccolto per la valutazione della vitamina A sierica. La randomizzazione sarà stratificata da tre cliniche utilizzando un disegno a blocchi bilanciati. Questa integrazione settimanale continuerà fino a 6 mesi dopo il parto. La dose integrativa di vitamina A da utilizzare in questo studio è simile alle dosi utilizzate settimanalmente tra le donne in gravidanza in altri studi (Semba et al., 1999; Cox et al., 2006) e si è dimostrata sicura. Gli operatori sul campo consegneranno gli integratori alle mamme, di persona e ne osserveranno direttamente il consumo. A 26-28 settimane di gestazione, tutte le madri riceveranno il vaccino contro il virus dell'influenza trivalente inattivato (GlaxoSmithKline; Dresda, Germania). I ceppi standard di influenza trivalente inattivati ​​A/H3N2, A/H1N1 e B raccomandati dall'OMS per l'emisfero settentrionale saranno ottenuti da fonti commerciali per questo progetto. Il medico dello studio somministrerà il vaccino per via intramuscolare. Al momento del parto, verranno raccolti sangue cordonale e colostro per la valutazione rispettivamente delle IgG e delle sIgA specifiche dell'influenza e della concentrazione di vitamina A. Verranno registrati anche il peso alla nascita e la lunghezza dei neonati. A 6 mesi, il latte materno sarà raccolto per la valutazione della vitamina A e delle sIgA specifiche del virus dell'influenza e il sangue venoso (2-3 ml) dai neonati (6 mesi di età) sarà ottenuto anche per la valutazione della vitamina A e delle IgG specifiche del virus dell'influenza come lavaggi nasali dei neonati per la valutazione delle sIgA specifiche del virus dell'influenza. Il nostro studio proposto non ostacolerà l'assistenza prenatale esistente per le madri come l'integrazione di folato/ferro o il programma di vaccinazione infantile esistente in Bangladesh.

Randomizzazione: ad ogni madre verrà assegnato un numero identificativo univoco generato casualmente, che indicherà il gruppo di studio a cui è assegnata. Lo stesso ID sarà etichettato sul flacone contenente 60 capsule. Gli assistenti sul campo useranno queste capsule per l'integrazione settimanale assicurandosi che il numero ID della madre e l'ID del biberon siano gli stessi. Una terza parte (laboratori ACME, Dhaka Bangladesh) preparerà e fornirà capsule di vitamina A o placebo in flaconi, etichettati con numeri ID da un elenco di numeri. Il personale responsabile lo manterrà riservato fino alla fine dello studio

Raccolta del campione: il sangue periferico della madre, il sangue del cordone ombelicale, il colostro, il latte materno, il sangue periferico e i lavaggi nasali dei neonati saranno raccolti come descritto nella Figura 1. Le secrezioni nasali saranno ottenute introducendo stoppini (applicatori di cotone) nella narice e ruotandoli delicatamente per 90 secondi come descritto in precedenza (Wright et al., 1996). Gli stoppini saranno estratti in 1mL di PBS, centrifugati, ed i sopranatanti saranno raccolti. Tutti i campioni verranno congelati fino al momento del test simultaneo.

Valutazione sierologica: abbiamo scelto di studiare le risposte immunitarie umorali solo a un antigene influenzale perché lo scopo di questo studio proposto è valutare l'effetto dell'integrazione materna di vitamina A sui livelli di anticorpi passivi dei neonati, quindi è prudente indagare le risposte immunitarie ad un antigene. Saranno testati i seguenti parametri della vitamina A e dell'immunità umorale specifica dell'influenza A.

Valutazione della vitamina A: il contenuto di vitamina A nel plasma, nel siero, nel colostro e nel latte materno sarà misurato con il metodo HPLC standard in atto nel laboratorio di biochimica nutrizionale dell'LSD.

Test di inibizione dell'emoagglutinazione [HAI]: i titoli anticorpali di HAI saranno misurati mediante test di microtitolo standard (Admon et al., 1997). 12 unità HA del ceppo vaccinale dell'Influenza A selezionato verranno aggiunte a sieri diluiti pretrattati con enzima di distruzione del recettore (RDE, Sigma MO) e inattivazione termica. Dopo l'incubazione, verranno aggiunti eritrociti di pollo lavati fino a quando non si verificherà la sedimentazione nei pozzetti di controllo. Il titolo HAI è l'inverso della massima diluizione del siero che mostra HAI completo.

IgG e sIgA specifiche dell'influenza ELISA: IgG specifiche del virus dell'influenza A nel siero/plasma e sIgA nel colostro, nel latte materno e nel tampone nasale del neonato saranno analizzate mediante ELISA come descritto in precedenza con modifiche minori (Bruhl et al., 2000; Greenbaum et al. ., 2004). Brevemente le immunopiastre saranno rivestite con antigene influenzale purificato ottenuto da NIBSC a 2 ug/mL per una notte a 40°C. e quindi verranno aggiunti campioni diluiti per un'altra incubazione durante la notte. Come coniugati verranno utilizzate anti-IgG umane coniugate con HRP (BD-Pharmingen, CA) o anti-sIgA di topo, marcate con perossidasi (Alpco Diagnostics, NH). Per costruire una curva standard, in ciascuna piastra ELISA verrà introdotta una diluizione seriale di campioni aggregati assegnati con un valore arbitrario. Le sIgA totali nel colostro, nel latte materno e nel tampone nasale del neonato saranno determinate anche dal kit EIA (Alpco Diagnostics) per regolare la risposta sIgA specifica dell'influenza A rispetto alla secrezione complessiva di sIgA.