不同结合珠蛋白表型在 COPD 频繁加重者与非加重者患者中的患病率

实验室程序：

概述：

将收集 3 毫升血清，并在 4 摄氏度（最多一周）或负 20 摄氏度下储存，直至交付至实验室。

触珠蛋白表型将在 B. Rappaport 医学院解剖学和细胞生物学系确定，地址为 1 Efron st. 以色列海法。 表型 Hp 的方法是蛋白凝胶电泳。

剩余的血清将在卡梅尔医学中心血清学实验室肺病学研究所专用的冷冻架中在负 70 摄氏度下冷冻 5 年，以供日后进行蛋白质分析。

触珠蛋白电泳：

触珠蛋白根据大小进行分离。 Hp 2-2 最大，因此预计在凝胶中移动的距离最短，而 Hp 1-1 最小，因此在凝胶中移动的距离最远。 用于电泳的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶。 使用两种浓度以提供加载和分离条件。

下面的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶，包含 10.8 ml 1M Tris pH 8.8、3.55 ml 丙烯酰胺 40%、11.5 ml dH2O、225 μl 10% 过硫酸铵 (APS) 和 18 μl 四甲基乙二胺 (TEMED)。 上层凝胶是聚丙烯酰胺凝胶，包含 937.5 μl 1M Tris pH 6.8、787.5 μl 丙烯酰胺 40%、5.7 ml dH2O、75 μl APS 10% 和 7.5 μl TEMED。

将下层凝胶倒入两个玻璃板之间并静置 30 分钟以固化。 一旦下层凝胶凝固，将上层凝胶倒在上面，静置 30 分钟以凝固。 Wells comb 放置在上层凝胶上方，以便为样品放置创建孔。

使用 10 μl 血清、2 μl 血红蛋白和 12 μl 商业上样缓冲液制备每位患者的样品。 然后使用移液器将样品小心地放入准备好的孔中。 4 个孔保留用于 Hp 2-2、Hp 2-1 和 Hp 1-1 的 3 个控制，后面是一个空井。

通过 BIO-RAD 在 Protean II xi 细胞中运行蛋白质印迹分析。 组装设备并加入电泳缓冲液。 运行缓冲液包含 15.1 g Tris、72 g 甘氨酸和 1000 ml DDW。 然后将电泳缓冲液置于 Protean II 的上部和下部容器中。 电泳在 240 伏特下运行 3 小时。

一旦样品完成运行，凝胶就会从玻璃板之间移除。 然后使用彩色染色溶液对凝胶进行染色。 使用 40 毫克 3,3'-5,5' 四甲基联苯胺和 20 毫升甲醇制备该溶液。 将其混合 15 分钟。 接下来加入 2 ml 二甲基亚砜并混合 5 分钟。 随后加入由 2 毫升 AA 和 38 毫升 DDW 制成的 40 毫升 5% 乙酸。 接着加入溶解在4ml DDW中的40mg铁氰化钾。 最后将 600 μl H2O2 添加到染色溶液中并混合 10 分钟。

染色溶液准备好后，将凝胶放入 22 cm x 32 cm 的托盘中，然后将染色溶液倒在凝胶上。 然后将托盘放在振荡器上 25 分钟。 一旦凝胶完成染色，它就清晰可见。 然而，凝胶被拍照用于图像增强和数据存储。 将凝胶从托盘中取出并放入用于成像的图像分析仪 (Imagequant LAS 4000) 或 Canon powershot sx40 hs 数码相机中。

数据制表：

数据——具有相应 ID 的触珠蛋白表型——被收集并制成 Microsoft Excel 表格。