Prevalência de Diferentes Fenótipos de Haptoglobina em Pacientes com DPOC - Exacerbadores Frequentes Versus Não Exacerbadores

Procedimentos laboratoriais:

Visão geral:

3 ml de Soro serão coletados e armazenados a 4 graus Celsius (até uma semana) ou menos 20 graus Celsius até a entrega ao laboratório.

O fenótipo da haptoglobina será determinado no Departamento de Anatomia e Biologia Celular da Faculdade de Medicina B. Rappaport, 1 Efron st. Haifa, Israel. O método para a fenotipina Hp é a eletroforese em gel de proteína.

O soro restante será mantido congelado em -70 graus Celsius por 5 anos em uma prateleira de freezer dedicada ao Instituto de Pneumologia no Laboratório de Sorologia do Carmel Medical Center para futuras análises de proteínas.

Eletroforese de Haptoglobina:

A proteína Haptoglobina é separada com base no tamanho. Hp 2-2 é o maior, portanto, esperava-se que percorresse a menor distância no gel e Hp 1-1 é o menor e, portanto, percorreria o gel mais longe. O gel usado para a eletroforese foi um gel de poliacrilamida. Duas concentrações são usadas para fornecer condições de carga e separação.

O gel inferior é um gel de poliacrilamida que contém 10,8 ml de Tris 1M pH 8,8, 3,55 ml de acrilamida 40%, 11,5 ml de dH2O, 225 μl de persulfato de amônio (APS) 10% e 18 μl de tetrametiletilenodiamina (TEMED). O gel superior é um gel de poliacrilamida que contém 937,5 μl de 1M Tris pH 6,8, 787,5 μl de acrilamida 40%, 5,7 ml de dH2O, 75 μl de APS 10% e 7,5 μl de TEMED.

O gel inferior é colocado entre duas placas de vidro e deixado por 30 minutos para solidificar. Uma vez que o gel inferior é solidificado, o gel superior é derramado sobre ele e deixado por 30 minutos para solidificar. Pente de poços colocado superiormente ao gel superior para criar poços para colocação de amostras.

A amostra para cada paciente é preparada usando 10 μl de soro, 2 μl de hemoglobina e 12 μl de tampão de carga comercial. A amostra é então cuidadosamente colocada nos poços preparados usando uma pipeta. 4 poços são reservados para 3 controles de Hp 2-2, Hp 2-1 e Hp 1-1 seguidos medialmente por um poço vazio.

A análise de western blot é realizada em uma célula Protean II xi por BIO-RAD. O aparelho é montado e um buffer de corrida de eletroforese é adicionado. O tampão de corrida contém 15,1 g de Tris, 72 g de glicina e 1000 ml de DDW. O buffer de execução foi então colocado no reservatório superior e inferior do Protean II. A eletroforese foi realizada a 240 Volts por 3 horas.

Depois que as amostras terminam de correr, o gel é removido entre as placas de vidro. O gel foi então corado com uma solução de coloração. A solução foi preparada usando 40 mg de 3,3'-5,5' tetrametil benzidina e 20 ml de metanol. Isso foi deixado para misturar por 15 minutos. Em seguida, 2 ml de dimetil sulfóxido são adicionados e deixados para misturar por 5 min. Seguiu-se a adição de 40 ml de ácido acético a 5% que é composto por 2 ml de AA e 38 ml de DDW. Em seguida, são adicionados 40 mg de fericianeto de potássio dissolvido em 4 ml de DDW. Finalmente, 600 μl de H2O2 são adicionados à solução de coloração e deixados para misturar por 10 min.

Uma vez que a solução de coloração esteja pronta, o gel é colocado em uma bandeja de 22 cm por 32 cm e a solução de coloração é derramada sobre o gel. A bandeja é então colocada em um agitador por 25 minutos. Assim que o Gel terminar de ser manchado, ele ficará legível. No entanto, o gel é fotografado para aprimoramento de imagem e armazenamento de dados. O gel é removido da bandeja e colocado em um Image Analyzer (Imagequant LAS 4000) para geração de imagens ou em uma câmera digital Canon powershot sx40 hs.

Tabulação de dados:

Os dados - o fenótipo da Haptoglobina com IDs correspondentes - são reunidos e tabulados em uma tabela do Microsoft Excel.