Erilaisten haptoglobiinifenotyyppien esiintyvyys keuhkoahtaumatautia sairastavilla potilailla – usein esiintyviä pahentajia verrattuna ei-pahentajiin

Laboratoriotoimenpiteet:

Yleiskatsaus:

3 ml seerumia kerätään ja säilytetään 4 celsiusasteessa (enintään viikko) tai miinus 20 celsiusasteessa laboratorioon toimitukseen saakka.

Haptoglobiinin fenotyyppi määritetään anatomian ja solubiologian laitoksella, B. Rappaportin lääketieteellisessä tiedekunnassa, 1 Efron st. Haifa, Israel. Menetelmä fenotyyppi Hp:lle on proteiinigeelielektroforeesi.

Jäljelle jäänyt seerumi säilytetään pakastettuna miinus 70 celsiusasteessa 5 vuoden ajan pakastinhyllyssä, joka on omistettu Carmel Medical Centerin serologian laboratorion pulmonologian instituutille tulevaa proteiinianalyysiä varten.

Haptoglobiinielektroforeesi:

Haptoglobiiniproteiini erotetaan koon perusteella. Hp 2-2 on suurin, joten sen odotettiin kulkevan lyhimmän matkan geelissä ja Hp 1-1 on pienin ja kulkee siksi kauimpana geelissä. Elektroforeesissa käytetty geeli oli polyakryyliamidigeeli. Käytetään kahta pitoisuutta lastaus- ja erotusolosuhteiden aikaansaamiseksi.

Alempi geeli on polyakryyliamidigeeli, joka sisältää 10,8 ml 1 M Tris pH 8,8, 3,55 ml akryyliamidi 40%, 11,5 ml dH2O, 225 μl ammoniumpersulfaattia (APS) 10% ja 18 μl ditetraamiinia (TEmetyylietyleeni). Ylempi geeli on polyakryyliamidigeeli, joka sisältää 937,5 μl 1 M Tris pH 6,8, 787,5 μl akryyliamidi 40%, 5,7 ml dH2O, 75 μl APS 10 % ja 7,5 μl TEMED.

Alempi geeli kaadetaan kahden lasilevyn väliin ja jätetään 30 minuutiksi jähmettymään. Kun alempi geeli on jähmettynyt, ylempi geeli kaadetaan sen päälle ja jätetään 30 minuutiksi jähmettymään. Kuoppakampa sijoitettu ylemmän geelin yläpuolelle, jotta voidaan luoda kuoppia näytteen sijoittamista varten.

Jokaisen potilaan näyte valmistetaan käyttämällä 10 μl seerumia, 2 μl hemoglobiinia ja 12 μl kaupallista latauspuskuria. Näyte laitetaan sitten varovasti valmistettuihin kuoppiin pipetillä. 4 kuoppaa on varattu kolmelle Hp 2-2:n, Hp 2-1:n ja Hp 1-1:n kontrollille, jota seuraa mediaalisesti tyhjä kuoppa.

Western blot -analyysi suoritetaan Protean II xi -solussa BIO-RAD:lla. Laite kootaan ja elektroforeesikäyntipuskuri lisätään. Ajopuskuri sisältää 15,1 g Trisiä, 72 g glysiiniä ja 1000 ml DDW:tä. Ajopuskuri laitettiin sitten Protean II:n ylä- ja alasäiliöön. Elektroforeesia ajettiin 240 voltilla 3 tunnin ajan.

Kun näytteet ovat loppuneet, geeli poistetaan lasilevyjen välistä. Sitten geeli värjättiin käyttämällä värivärjäysliuosta. Liuos valmistettiin käyttämällä 40 mg 3,3'-5,5'-tetrametyylibentsidiiniä ja 20 ml metanolia. Tämän annettiin sekoittua 15 minuuttia. Seuraavaksi lisätään 2 ml dimetyylisulfoksidia ja annetaan sekoittua 5 minuuttia. Tämän jälkeen lisättiin 40 ml 5-prosenttista etikkahappoa, joka on valmistettu 2 ml:sta AA:ta ja 38 ml:sta DDW:tä. Seuraavaksi lisätään 40 mg kaliumferisyanidia liuotettuna 4 ml:aan DDW:tä. Lopuksi värjäysliuokseen lisätään 600 μl H2O2:ta ja annetaan sekoittua 10 minuuttia.

Kun värjäysliuos on valmis, geeli asetetaan 22 cm x 32 cm alustalle ja värjäysliuos kaadetaan geelin päälle. Sitten tarjotin asetetaan ravistelijalle 25 minuutiksi. Kun geeli on värjätty, se on luettavissa. Siitä huolimatta geeli on valokuvattu kuvan parantamiseksi ja tietojen tallentamiseksi. Geeli poistetaan alustalta ja asetetaan Image Analyzeriin (Imagequant LAS 4000) kuvantamista varten tai Canon powershot sx40 hs -digitaalikameraan.

Tietotaulukko:

Tiedot - Haptoglobin-fenotyyppi vastaavilla tunnuksilla - kerätään ja taulukoidaan Microsoft Excel -taulukkoon.