Występowanie różnych fenotypów haptoglobiny u pacjentów z POChP z częstymi zaostrzeniami w porównaniu z osobami bez zaostrzeń

Procedury laboratoryjne:

Przegląd:

Pobrane zostaną 3 ml Serum i będą przechowywane w temperaturze 4 stopni Celsjusza (do jednego tygodnia) lub minus 20 stopni Celsjusza do momentu dostarczenia do laboratorium.

Fenotyp haptoglobiny zostanie określony w Zakładzie Anatomii i Biologii Komórki Wydziału Lekarskiego im. B. Rappaporta, ul. Hajfa, Izrael. Metodą fenotypiny Hp jest elektroforeza w żelu białkowym.

Pozostała surowica będzie przechowywana zamrożona w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza przez 5 lat w zamrażarce przeznaczonej dla Instytutu Pulmonologii w Laboratorium Serologicznym Centrum Medycznego Carmel do przyszłych analiz białek.

Elektroforeza haptoglobiny:

Białko haptoglobiny jest rozdzielane na podstawie wielkości. Hp 2-2 jest największy, dlatego oczekiwano, że pokona najkrótszą odległość w żelu, a Hp 1-1 jest najmniejszy, a zatem będzie przemieszczał się najdalej w żelu. Żelem stosowanym do elektroforezy był żel poliakryloamidowy. Stosuje się dwa stężenia w celu zapewnienia warunków obciążania i rozdzielania.

Dolny żel to żel poliakrylamidowy, który zawiera 10,8 ml 1M Tris pH 8,8, 3,55 ml 40% akrylamidu, 11,5 ml dH2O, 225 μl nadsiarczanu amonu (APS) 10% i 18 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Górny żel to żel poliakryloamidowy, który zawiera 937,5 μl 1M Tris pH 6,8, 787,5 μl 40% akrylamidu, 5,7 ml dH2O, 75 μl 10% APS i 7,5 μl TEMED.

Dolny żel wlewa się pomiędzy dwie szklane płytki i pozostawia na 30 minut do zestalenia. Gdy dolny żel stwardnieje, górny żel wylewa się na niego i pozostawia na 30 minut do zestalenia. Grzebień dołków umieszczony nad górnym żelem w celu utworzenia dołków do umieszczenia próbki.

Próbkę dla każdego pacjenta przygotowuje się, używając 10 μl surowicy, 2 μl hemoglobiny i 12 μl dostępnego w handlu buforu do nanoszenia. Próbkę następnie ostrożnie umieszcza się w przygotowanych dołkach za pomocą pipety. 4 studzienki są zarezerwowane dla 3 kontroli Hp 2-2, Hp 2-1 i Hp 1-1, po których następuje pusta studzienka pośrodku.

Analizę Western blot przeprowadza się w komórce Protean II xi przez BIO-RAD. Aparat jest montowany i dodaje się bufor do elektroforezy. Bufor roboczy zawiera 15,1 g Tris, 72 g glicyny i 1000 ml DDW. Następnie bufor roboczy umieszczono w górnym i dolnym zbiorniku Protean II. Elektroforezę prowadzono pod napięciem 240 woltów przez 3 godziny.

Po zakończeniu analizy próbek żel jest usuwany spomiędzy szklanych płytek. Następnie żel barwiono za pomocą roztworu barwiącego. Roztwór sporządzono stosując 40 mg 3,3'-5,5' tetrametylobenzydyny i 20 ml metanolu. Pozostawiono to do wymieszania na 15 minut. Następnie dodaje się 2 ml sulfotlenku dimetylu i pozostawia do wymieszania na 5 min. Następnie dodano 40 ml 5% kwasu octowego, który składa się z 2 ml AA i 38 ml DDW. Następnie dodaje się 40 mg fericyjanku potasu rozpuszczonego w 4 ml DDW. Na koniec do roztworu barwiącego dodaje się 600 μl H2O2 i pozostawia do wymieszania na 10 min.

Gdy roztwór barwiący jest gotowy, żel umieszcza się na tacy o wymiarach 22 cm na 32 cm i roztwór barwiący wylewa się na żel. Następnie tacę umieszcza się na wytrząsarce na 25 minut. Po zakończeniu barwienia żelu jest on czytelny. Niemniej jednak żel jest fotografowany w celu poprawy obrazu i przechowywania danych. Żel usuwa się z tacy i umieszcza w analizatorze obrazu (Imagequant LAS 4000) do obrazowania lub w aparacie cyfrowym Canon powershot sx40 hs.

Tabele danych:

Dane — fenotyp haptoglobiny z odpowiednimi identyfikatorami — są gromadzone i umieszczane w tabeli programu Microsoft Excel.