Prevalencia de diferentes fenotipos de haptoglobina en pacientes con EPOC: exacerbadores frecuentes versus no exacerbadores

Procedimientos de laboratorio:

Descripción general:

Se recolectarán 3 ml de Suero y se almacenarán a 4 grados centígrados (hasta una semana) o menos 20 grados centígrados hasta su entrega al laboratorio.

El fenotipo de haptoglobina se determinará en el Departamento de Anatomía y Biología Celular, Facultad de Medicina B. Rappaport, 1 Efron st. Haifa, Israel. El método para la fenotipina Hp es la electroforesis en gel de proteínas.

El suero restante se mantendrá congelado a menos 70 grados centígrados durante 5 años en un estante congelador dedicado al Instituto de Neumología en el Laboratorio de Serología en el Centro Médico Carmel para futuros análisis de proteínas.

Electroforesis de haptoglobina:

La proteína haptoglobina se separa en función del tamaño. Hp 2-2 es el más grande, por lo que se esperaba que viajara la distancia más corta en el gel y Hp 1-1 es el más pequeño y, por lo tanto, viajaría más lejos en el gel. El gel que se utilizó para la electroforesis fue un gel de poliacrilamida. Se utilizan dos concentraciones para proporcionar condiciones de carga y separación.

El gel inferior es un gel de poliacrilamida que contiene 10,8 ml de Tris 1 M pH 8,8, 3,55 ml de acrilamida al 40 %, 11,5 ml de dH2O, 225 μl de persulfato de amonio (APS) al 10 % y 18 μl de tetrametiletilendiamina (TEMED). El gel superior es un gel de poliacrilamida que contiene 937,5 μl de Tris 1 M pH 6,8, 787,5 μl de acrilamida al 40 %, 5,7 ml de dH2O, 75 μl de APS al 10 % y 7,5 μl de TEMED.

El gel inferior se vierte entre dos placas de vidrio y se deja solidificar durante 30 minutos. Una vez que el gel inferior se solidifica, el gel superior se vierte encima y se deja durante 30 minutos para que se solidifique. Peine de pozos colocado superiormente al gel superior para crear pozos para la colocación de muestras.

La muestra de cada paciente se prepara con 10 μl de suero, 2 μl de Hemoglobina y 12 μl de un tampón de carga comercial. A continuación, la muestra se coloca con cuidado en los pocillos preparados con una pipeta. Se reservan 4 pocillos para 3 controles de Hp 2-2, Hp 2-1 y Hp 1-1 seguidos medialmente por un pocillo vacío.

El análisis de transferencia Western se realiza en una celda Protean II xi por BIO-RAD. Se ensambla el aparato y se agrega un tampón de ejecución de electroforesis. El tampón de ejecución contiene 15,1 g de Tris, 72 g de Glicina y 1000 ml de DDW. Luego, el tampón de funcionamiento se colocó en el depósito superior e inferior del Protean II. La electroforesis se realizó a 240 voltios durante 3 horas.

Una vez que las muestras terminan de correr, el gel se retira de entre las placas de vidrio. A continuación, el gel se tiñó con una solución de tinción de color. La solución se preparó utilizando 40 mg de 3,3'-5,5' tetrametil bencidina y 20 ml de metanol. Esto se dejó mezclar durante 15 minutos. A continuación se añaden 2 ml de dimetilsulfóxido y se deja mezclar durante 5 min. Esto fue seguido por la adición de 40 ml de ácido acético al 5% que se prepara con 2 ml de AA y 38 ml de DDW. A continuación se añaden 40 mg de fericianuro potásico disueltos en 4 ml de DDW. Finalmente se añaden 600 μl de H2O2 a la solución de tinción y se deja mezclar durante 10 min.

Una vez que la solución de tinción está lista, se coloca el gel en una bandeja de 22 cm por 32 cm y se vierte la solución de tinción sobre el gel. A continuación, la bandeja se coloca en un agitador durante 25 minutos. Una vez que se termina de teñir el Gel es legible. No obstante, el gel se fotografía para mejorar la imagen y almacenar datos. El gel se retira de la bandeja y se coloca en un analizador de imágenes (Imagequant LAS 4000) para formación de imágenes, o en una cámara digital Canon powershot sx40 hs.

Tabulación de datos:

Los datos, el fenotipo de haptoglobina con las identificaciones correspondientes, se recopilan y tabulan en una tabla de Microsoft Excel.