膳食植物雌激素可以减缓前列腺肿瘤的增殖吗？ (PRODICA)

来自生态学和实验研究的数据清楚地表明膳食植物雌激素对前列腺癌具有保护作用。 遗传因素在前列腺癌的病因学中也很重要，越来越多的证据表明基因-饮食相互作用在前列腺癌进展中的重要性。 研究人员最近发现了植物雌激素这种保护作用的假定遗传相互作用。 雌激素受体-β (ERß) 基因中的核苷酸序列变异强烈改变了摄入大量植物雌激素的男性患前列腺癌的总体风险降低。 美国的一项研究发现，摄入植物雌激素、体重指数 (BMI) 和 ERß 中的另一种核苷酸序列变体之间存在类似的相互作用。植物雌激素异黄酮和香豆素与雌激素受体-β (ERß) 紧密结合，主要存在于大豆和其他豆类中。 已发现 ERß 表达与前列腺癌的进展有关，这表明植物雌激素可能在前列腺癌的发展过程中与 ERß 相互作用。 关于潜在的致癌机制，植物雌激素可能通过影响 AR 和 ERß 之间的平衡参与前列腺细胞生长的内分泌控制。睾酮及其代谢物 5α-二氢睾酮 (DHT) 通过与 AR 结合导致前列腺上皮细胞增殖。 相比之下，DHT 的代谢产物 5α 雄烷-3ß,17ß-二醇 (3ßAdiol) 通过与 ERß 结合，抑制 AR 的表达，从而抑制雄激素驱动的增殖，同时促进细胞分化。 在增殖方面，当前数据表明 ERα 和 AR 在前列腺中具有联合刺激作用，而 ERß 抑制增殖并刺激分化。 雌激素 ERα 和 ß 均对雌二醇具有亲和力，而植物雌激素和 3ßAdiol 可选择性激活 ERß。 因此，植物雌激素应该能够通过替代 3ßAdiol 来限制癌症的生长。 实验研究证实了这一点。

先前干预研究的结果给出了有希望的结果，表明某些饮食或生活方式的改变可以影响前列腺癌的进展，尽管这些研究中的大多数持续时间相当短并且基于相对较少的患者。 例如，一项随机研究表明，与饮食中未添加亚麻籽的男性相比，饮食中添加亚麻籽的男性含有增殖标志物 Ki-67 的阳性细胞百分比较低。 综上所述，目前的证据表明，前列腺癌患者有可能补充与生活方式相关的治疗方案，以预防或延缓肿瘤进展。

具体目标：对患有前列腺癌的男性进行随机对照饮食干预研究。 调查人员将追求以下具体目标/假设：

1. “在患有中等风险前列腺癌的男性中，与饮食中植物雌激素含量低的男性相比，饮食中植物雌激素含量高的饮食会减少肿瘤的进展”。
2. “富含植物雌激素的饮食对前列腺癌肿瘤进展的影响在 ERß 基因具有不同基因型多态性的男性之间有所不同”。 这些男性将被分为两个亚组，即携带 ERß 基因中单核苷酸多态性 (SNP) rs2987983-13950 T/C 的 TT 或 TC/CC 等位基因的亚组，将在其中检验假设。
3. 确定前列腺肿瘤组织中 AR、ERα 和 ERβ 的 RNA 表达以及类固醇激素水平是否分别在饮食中植物雌激素含量高和低的男性之间或在 ERβ 基因的不同基因型之间存在差异。
4. 确定前列腺切除术标本中通过全转录组学分析分析的增殖和 ER 信号通路相关基因的 mRNA 表达是否分别在饮食中植物雌激素含量高和低的男性之间或在 ERβ 基因的不同基因型之间存在差异。

研究方案：通过治疗医生，研究人员将在 Västra Götaland 医疗保健地区确定 240 名被诊断患有中等风险水平（T1-T2，格里森评分）前列腺癌的男性

干预：患者将由营养师介绍干预饮食，并获得有关健康食物选择的一般信息（根据对公众的建议），不吃任何膳食补充剂，不会给予其他饮食限制。 将向患者提供含有大量植物雌激素（≥100 mg 异黄酮和≥100 mg 木酚素）的食物包装，每天食用。 干预持续到手术前一天（至少 6 周）。 对照组的患者将以与干预组相同的方式被告知，只是他们不会收到任何食品包装。

终点：饮食对肿瘤增殖率的影响将通过比较 1）含有标记物 Ki-67 的阳性细胞百分比，2）PSA 水平，3）参与增殖和 ER 信号通路的基因表达和细胞周期进程 (CCP) 基因表达。 根据先前诊断活检和磁共振成像的结果，外科医生在紧邻手术的地方从新鲜的前列腺标本中采集了四份正中针活检，两份来自肿瘤部位，两份来自健康的前列腺组织。 ，收集根治性前列腺切除组织，福尔马林固定石蜡包埋。 将在研究开始时、手术前一天采集血样，并送去进行 PSA 分析（免费和总计）。 将计算 PSA 水平和 PSA 倍增时间的绝对差异。 此外，研究人员还将测量肿瘤组织中 AR、ERα 和 ERß 的表达以及激素、睾酮、DHT、雌二醇和 3ß-Adiol 的血液水平。

问卷：所有患者将在基线、手术、体重和身高时回答一份密码保护的问卷。 在 6 周期间将进行一次 24 小时回忆访谈，其中将记录参与者在前 24 小时内的食物摄入量。 通过将问卷和饮食记录中的信息与国家食品局的营养数据库和我们之前开发的植物雌激素数据库联系起来，可以估算出个体能量和特定营养素的摄入量。 将从医疗记录中收集有关可能使用 5α-还原酶抑制剂非那雄胺的信息。

多态性分析：将使用基于 PCR 的竞争等位基因特异性 PCR (KASP™) 方法对血液样本中的 ERß 基因中的 S​​NP 进行分析。 等位基因构成将被识别，参与者将被分配到 TT、TC 或 CC 组。 Ki-67 分析：通过在 +4°C 下用 4% 多聚甲醛在 0.1 M 磷酸盐缓冲液中浸泡 24 小时来固定活检样本。 然后用梯度乙醇脱水，然后进行二甲苯和石蜡包埋。 石蜡切片在 60ºC 下加热 30 分钟，并用柠檬酸缓冲液进行预处理。 非特异性结合在含有 Triton X-100 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中被驴血清阻断 30 分钟。 与 Ki-67 抗体孵育过夜 (4ºC)，然后与适当的生物素化二抗孵育。 为了增强信号，切片用抗生物素蛋白-生物素复合物溶液处理，并使用二氨基联苯胺 (DAB) 可视化免疫反应性。 将对染色的肿瘤细胞（Ki-67 阳性）进行计数，并将结果报告为阳性细胞核除以评估的总数×100 的比率。

受体表达、CCP 评分、激素水平和 PSA 的分析：手术中采集的组织样本在冷冻前先放入 RNA 中。 样本将使用 RNeasy plus Universal Mini Kits (QIAGEN) 和实时聚合酶链反应 (PCR) 进行分析。 将使用 TaqMan 测定法确定 ERα、ERβ 和 AR mRNA 表达。 使用全转录组表达阵列 Clariom™ D (Thermos Fischer)，从福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤和良性组织切片中提取总 RNA。 为了分析 CCP 分数，CCP 相关基因的基因表达分别基于 Prolaris® 基因组和 Decipher 分数。将根据标准临床方案分析 PSA 血液水平。

功效计算：2012 年，在 Västra Götaland 医疗保健区，321 名男性患有中度风险水平的前列腺癌，他们接受了治愈性治疗。 使用主要结果 (Ki-67) 的计算为由 118 名患者组成的研究组提供了 80% 的双侧检验功效，显着性水平为 0.05，效应大小为 0.5。 研究人员在早期研究中发现，大约 42% 的男性群体对于 ERβ 启动子区域 SNP (rs2987983-13950 T/C) 的变异等位基因 (TC/CC) 是杂合子或纯合子，58% 是野生型等位基因的纯合子（TT）。 由于研究人员预计干预的效果在具有变异等位基因的受试者中更大，而在具有野生型等位基因的受试者中更小，因此后一组应该足够大以便能够发现差异（如果存在）。 因此，需要 118/58%=203 名患者的总样本量。

统计考虑：研究人员将使用意向治疗方法。 在药物的设计和数据收集测试中已经进行了模板测试（随机化、安慰剂、盲法、无损耗、无差异测量误差、正确分析）；对于与完美情况的偏差，调查人员使用流行病学理论来指导分析和解释结果。 将提供基于均值、中位数、标准差和分位数范围的初步分析，以正确描述感兴趣的结果，并将进行分层以评估分配饮食随机化的性能。 因此，将制作箱线图以图形方式评估响应中的时间趋势。 将研究结果的分布，并在需要时应用适当的转换以改善对称性和正态性。 由于数据的纵向结构，将结合观察之间的相关性并进行线性混合效应模型以研究是否（i）存在时间趋势（ii）治疗和未治疗个体之间的线性趋势是否不同（iii） ) 如果干预组和对照组之间的治疗效果根据 ERß 基因型进行了修改，无论是常见的还是变异的。 纵向数据分析的一个关键步骤是确定描述数据点之间相关性的适当协方差结构：独立协方差（无相关性）、可交换协方差（等相关性）或自回归协方差，响应之间的相关性随测量之间的时间而降低。 研究人员将确定最合适的结构，并借助信息论方法进行实证验证。 将生成统计检验和置信区间来评估影响的显着性，因此将使用部分 F 检验程序来研究主要变量和交互变量的联合效应，并将应用适当的统计方法来研究模型拟合。 植物雌激素摄入量与癌症增殖之间的关联将通过广义线性模型进行评估，该模型将提供按 ERβ 基因型分层的风险差异 (RD) 和相应的 95% CI 的估计值。 将考虑加性效应量表来评估植物雌激素摄入量与 ERβ SNP 之间对增殖的相互作用。 一组植物雌激素摄入量作为连续变量包含在内，每个 SNP 由一个指示变量（变体或非变体）表示。 将通过代表植物雌激素摄入量和 SNP 基因型的协变量之间的乘积项在线性赔率模型中评估相互作用。