Mohou dietní fytoestrogeny zpomalit proliferaci nádoru prostaty? (PRODICA)

Údaje z ekologických a experimentálních studií jasně ukazují ochranný účinek dietních fytoestrogenů proti rakovině prostaty. Genetické faktory mají také etiologický význam u rakoviny prostaty a přibývá důkazů o důležitosti interakce gen-dieta v progresi rakoviny prostaty. Výzkumníci nedávno našli domnělou genetickou interakci pro tuto ochrannou roli fytoestrogenů. Celkové snížení rizika rakoviny prostaty u mužů s vysokým příjmem fytoestrogenů bylo silně modifikováno variantou nukleotidové sekvence v genu estrogenového receptoru-beta (ERß). Americká studie zjistila podobný interaktivní účinek mezi příjmem fytoestrogenů, stejně jako indexem tělesné hmotnosti (BMI) a jinou variantou nukleotidové sekvence v ERß. Fytoestrogeny isoflavonoidy a kumestany se pevně vážou na estrogenový receptor beta (ERß) a jsou převážně nachází se v sóji a dalších bobech. Bylo zjištěno, že exprese ERß se podílí na progresi rakoviny prostaty, což naznačuje, že fytoestrogeny mohou interagovat s ERß při rozvoji rakoviny prostaty. S ohledem na potenciální karcinogenní mechanismy se mohou fytoestrogeny podílet na endokrinní kontrole růstu buněk prostaty ovlivněním rovnováhy mezi AR a ERß. Testosteron a jeho metabolit 5α-dihydrotestosteron (DHT) způsobují proliferaci epiteliálních buněk prostaty vazbou na AR. Na rozdíl od toho 5α androstan-3ß,17ß-diol (3ßAdiol), metabolit DHT, vazbou na ERß, potlačuje expresi AR a tím inhibuje androgeny řízenou proliferaci a zároveň podporuje buněčnou diferenciaci. Pokud jde o proliferaci, současné údaje naznačují kombinovanou stimulační roli ERα a AR v prostatě, zatímco ERß inhibuje proliferaci a stimuluje diferenciaci. Estrogen ERα i ß mají afinitu k estradiolu, zatímco fytoestrogeny a 3ßAdiol selektivně aktivují ERß. Fytoestrogeny by v důsledku toho měly být schopny omezit růst rakoviny tím, že budou fungovat jako náhrada za 3ßAdiol. To potvrzují experimentální studie.

Výsledky předchozích intervenčních studií poskytly slibné výsledky, které naznačují, že určité úpravy stravy nebo životního stylu mohou ovlivnit progresi rakoviny prostaty, ačkoli většina těchto studií byla poměrně krátká a byla založena na relativně malém počtu pacientů. Randomizovaná studie například ukázala, že muži, kterým byla ve stravě přidána lněná semínka, měli nižší procento pozitivních buněk obsahujících proliferační marker Ki-67 než muži, kteří tento přídavek do stravy nedostali. Souhrnně řečeno, současné důkazy poukazují na možnost, aby pacienti s rakovinou prostaty doplňovali alternativy léčby související s životním stylem, aby se zabránilo nebo oddálilo progresi nádoru.

Specifický cíl: Provést kontrolovanou randomizovanou dietní intervenční studii u mužů s karcinomem prostaty. Vyšetřovatelé budou sledovat následující konkrétní cíle/hypotézy:

1. "U mužů s rakovinou prostaty střední úrovně rizika sníží dieta s vysokým obsahem fytoestrogenů progresi nádoru ve srovnání s muži s dietou s nízkým obsahem fytoestrogenů."
2. „Účinky stravy s vysokým obsahem fytoestrogenů na progresi nádoru rakoviny prostaty se u mužů s různými genotypy polymorfismů v genu ERß liší“. Muži budou rozděleni do dvou podskupin, nesoucích alely TT nebo TC/CC, jednonukleotidového polymorfismu (SNP) rs2987983-13950 T/C v genu ERß, ve kterých bude hypotéza testována.
3. Stanovit, zda se exprese RNA AR, ERα a ERβ v nádorové tkáni prostaty, stejně jako hladiny steroidních hormonů, liší mezi muži s dietou s vysokým a nízkým obsahem fytoestrogenů, v daném pořadí, nebo mezi různými genotypy genu ERβ.
4. Zjistit, zda se exprese mRNA genů zapojených do proliferace a ER signálních drah analyzovaných úplným transkriptomickým profilováním ve vzorcích z prostatektomie liší mezi muži s dietou s vysokým a nízkým obsahem fytoestrogenů, respektive mezi různými genotypy genu ERp.

Protokol studie: Prostřednictvím ošetřujících lékařů vyšetřovatelé identifikují 240 mužů ve zdravotnické oblasti Västra Götaland, u kterých byla diagnostikována rakovina prostaty střední úrovně rizika (T1-T2, Gleasonovo skóre

Intervence: Pacienti budou seznámeni s intervenční dietou dietologem a dostanou obecné informace o výběru zdravých potravin (podle doporučení pro širokou veřejnost) a nejíst žádné doplňky stravy, nebudou dána žádná další dietní omezení. Pacientkám bude podán balíček s potravinami s vysokým množstvím fytoestrogenů (≥100 mg isoflavonoidů a ≥100 mg lignanů), které mají být konzumovány denně. Intervence pokračuje do dne před operací (nejméně 6 týdnů). Pacienti v kontrolní skupině budou informováni stejným způsobem jako intervenční skupina s tím rozdílem, že nedostanou žádný potravinový balíček.

Koncový bod: Účinek stravy na rychlost proliferace nádoru bude měřen porovnáním 1) procenta pozitivních buněk obsahujících marker Ki-67, 2) hladin PSA, 3) exprese genů zapojených do proliferace a signálních drah ER a exprese genu pro progresi buněčného cyklu (CCP). V bezprostřední blízkosti ordinace chirurg odebere čtyři střední jehlové biopsie z čerstvého vzorku prostaty, dvě z místa nádoru a dvě ze zdravé tkáně prostaty, na základě předchozích výsledků z diagnostických biopsií a zobrazení magnetickou rezonancí. Také na ordinaci se odeberou tkáně po radikální prostatektomii a zalijí se do parafinu fixovaného formalínem. Vzorky krve budou odebrány na začátku studie, den před operací, a odeslány k analýze PSA (volné a celkové). Budou vypočítány absolutní rozdíly v hladinách PSA a doba zdvojnásobení PSA. Kromě toho budou vyšetřovatelé měřit expresi AR, ERα a ERß v nádorové tkáni a krevní hladiny hormonů, testosteronu, DHT, estradiolu a 3ß-adiolu.

Dotazník: Všichni pacienti na začátku odpoví na heslem chráněný dotazník, změří se operace, váha a výška. Jednou v průběhu 6 týdnů bude proveden 24hodinový vyvolávací rozhovor, ve kterém bude zaznamenán příjem potravy účastníků během předchozích 24 hodin. Individuální příjem energie a specifických živin bude odhadnut propojením informací z dotazníku a dietního záznamu s nutriční databází Národní agentury pro potraviny a naší dříve vyvinutou databází fytoestrogenů. Informace o možném použití Finasteridu, inhibitoru 5α-reduktázy, budou shromážděny z lékařských záznamů.

Analýza polymorfů:SNP v ERß-genu bude analyzována ve vzorcích krve pomocí metody založené na PCR kompetitivní alelově specifické PCR (KASP™). Bude identifikována alelová konstituce a účastníci budou zařazeni do skupiny TT, TC nebo CC. Analýza Ki-67: Vzorek biopsie je fixován ponořením do 4% paraformaldehydu v 0,1 M fosfátovém pufru po dobu 24 hodin při +4 °C. Poté se dehydratuje odstupňovaným ethanolem a následně se zalije xylenem a parafínem. Parafínové řezy se zahřívají po dobu 30 minut na 60 °C, předem se ošetří pufrem s kyselinou citrónovou. Nespecifická vazba je blokována oslím sérem ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) obsahujícím Triton X-100 po dobu 30 minut. Inkubace s protilátkou Ki-67 přes noc (4ºC) následovaná inkubací s vhodnou sekundární biotinylovanou protilátkou. Pro zesílení signálu jsou řezy ošetřeny roztokem komplexu avidin-biotin a pro vizualizaci imunoreaktivity se používá diaminobenzidin (DAB). Obarvené nádorové buňky (pozitivita Ki-67) budou spočítány a výsledek bude uveden jako poměr pozitivních jader dělený celkovým hodnoceným počtem × 100.

Analýza exprese receptoru, skóre CCP, hladiny hormonů a PSA: Vzorky tkáně odebrané při operaci jsou umístěny do RNA-později před zmrazením. Vzorky budou analyzovány pomocí RNeasy plus Universal Mini Kits (QIAGEN) a polymerázové řetězové reakce v reálném čase (PCR). Exprese mRNA ERa, ERp a AR bude stanovena pomocí testu TaqMan. Celková RNA bude extrahována z řezů nádorů a benigních tkání fixovaných v parafinu fixovaných ve formalínu za použití globálního expresního pole pro celý transkriptom Clariom™ D (Thermos Fischer). Pro analýzu skóre CCP, genové exprese genů zapojených do CCP na základě genového panelu Prolaris® a skóre Decipher Score, v daném pořadí. Hladiny PSA v krvi budou analyzovány podle standardního klinického protokolu.

Výpočet síly: Ve zdravotnickém regionu Västra Götaland mělo v roce 2012 321 mužů středně rizikovou rakovinu prostaty, kvůli které byli léčeni. Výpočet pomocí primárního výsledku (Ki-67) dává pro studijní skupinu sestávající ze 118 pacientů 80% sílu pro oboustranný test s hladinou významnosti 0,05 a velikostí účinku 0,5. Výzkumníci v dřívějších studiích zjistili, že přibližně 42 % mužské populace je heterozygotních nebo homozygotních pro variantní alelu (TC/CC) promotorové oblasti ERβ SNP (rs2987983-13950 T/C) a 58 % homozygotních pro alelu divokého typu. (TT). Protože výzkumníci očekávají, že účinek intervence bude větší u subjektů s variantní alelou, zatímco menší u subjektů s alelou divokého typu, tato druhá skupina by měla být dostatečně velká, aby byla schopna najít rozdíl, pokud existuje. Je tedy zapotřebí celková velikost vzorku 118/58 % = 203 pacientů.

Statistická hlediska: Vyšetřovatelé použijí metodu záměrné léčby. Při návrhu a sběru dat bylo provedeno testování léků jako šablony (randomizace, placebo, zaslepení, žádné opotřebení, žádné rozdílové chyby měření, správná analýza); pro odchylky od dokonalé situace vyšetřovatelé používají epidemiologickou teorii pro vedení analýz a interpretaci výsledků. Budou poskytnuty předběžné analýzy založené na průměrech, mediánech, směrodatných odchylkách a interkvantilovém rozmezí, aby se správně popsaly sledované výsledky, a provede se stratifikace pro posouzení účinnosti randomizace přidělené stravy. Budou proto vytvořeny krabicové grafy, aby bylo možné graficky vyhodnotit časové trendy odezvy. Bude studována distribuce výsledků a v případě potřeby budou použity vhodné transformace ke zlepšení symetrie a normality. Vzhledem k longitudinální struktuře dat bude začleněna korelace mezi pozorováními a budou provedeny lineární modely smíšených účinků, aby bylo možné studovat, zda (i) existuje časový trend (ii) pokud se lineární trend liší mezi léčenými a neléčenými jedinci (iii ) pokud je účinek léčby mezi intervenční skupinou a kontrolní skupinou modifikován podle genotypů ERß, a to jak u běžné, tak u varianty. Klíčovým krokem v analýze longitudinálních dat je identifikace vhodné kovarianční struktury, která popisuje korelace mezi datovými body: nezávislá kovariance (žádná korelace), výměnná kovariance (rovná korelace) nebo autoregresní kovariance s klesající korelací mezi reakcemi s časem mezi měřeními. Řešitelé identifikují nejvhodnější strukturu, empiricky ověřenou pomocí informačního teoretického přístupu. Pro posouzení významnosti efektů budou vytvořeny jak statistické testy, tak intervaly spolehlivosti, pro studium spojeného efektu hlavních a interakčních proměnných budou proto použity dílčí F testovací postupy a pro studium přizpůsobení modelu budou použity vhodné statistické metody. Souvislost mezi příjmem fytoestrogenů a proliferací rakoviny bude hodnocena zobecněnými lineárními modely, které poskytnou odhady rozdílu rizik (RD) a odpovídající 95% CI, stratifikované podle genotypů ERβ. Interakce mezi příjmem fytoestrogenů a ERβ SNP na proliferaci budou hodnoceny s ohledem na škály aditivního účinku. Skupiny příjmu fytoestrogenů jsou zahrnuty jako spojitá proměnná a každý SNP je reprezentován indikační proměnnou (varianta nebo ne). Interakce bude hodnocena v lineárním modelu pravděpodobnosti podle produktového termínu mezi kovariáty představujícími příjem fytoestrogenů a genotypy SNP.