I fitoestrogeni dietetici possono rallentare la proliferazione del tumore alla prostata? (PRODICA)

I dati provenienti da studi ecologici e sperimentali mostrano chiaramente un effetto protettivo dei fitoestrogeni alimentari contro il cancro alla prostata. I fattori genetici sono anche di importanza eziologica nel cancro alla prostata e ci sono prove crescenti dell'importanza di un'interazione gene-dieta nella progressione del cancro alla prostata. I ricercatori hanno recentemente trovato una presunta interazione genetica per questo ruolo protettivo dei fitoestrogeni. La riduzione complessiva del rischio di cancro alla prostata negli uomini con un'elevata assunzione di fitoestrogeni è stata fortemente modificata da una variante della sequenza nucleotidica nel gene del recettore beta degli estrogeni (ERß). Uno studio americano ha riscontrato un effetto interattivo simile tra l'assunzione di fitoestrogeni, così come l'indice di massa corporea (BMI) e un'altra variante della sequenza nucleotidica in ERß. I fitoestrogeni isoflavonoidi e cumestani si legano strettamente al recettore beta degli estrogeni (ERß) e si trova nella soia e in altri fagioli. È stato scoperto che l'espressione di ERß è coinvolta nella progressione del cancro alla prostata, suggerendo che i fitoestrogeni possono interagire con ERß nello sviluppo del cancro alla prostata. Per quanto riguarda i potenziali meccanismi cancerogeni, i fitoestrogeni possono essere coinvolti nel controllo endocrino della crescita delle cellule della prostata influenzando l'equilibrio tra AR e ERß. Il testosterone e il suo metabolita 5α-diidrotestosterone (DHT) causano la proliferazione delle cellule epiteliali della prostata attraverso il legame con l'AR. Al contrario, legandosi a ERß, 5α androstane-3ß,17ß-diol (3ßAdiol), un metabolita del DHT, reprime l'espressione di AR e quindi inibisce la proliferazione guidata dagli androgeni promuovendo la differenziazione cellulare. In termini di proliferazione, i dati attuali suggeriscono un ruolo stimolatorio combinato di ERα e AR nella prostata mentre ERß inibisce la proliferazione e stimola la differenziazione. Sia l'estrogeno ERα che il ß hanno affinità per l'estradiolo, mentre i fitoestrogeni e il 3ßAdiolo attivano selettivamente l'ERß. I fitoestrogeni dovrebbero, di conseguenza, essere in grado di limitare la crescita del cancro agendo come sostituti del 3ßAdiol. Ciò è confermato da studi sperimentali.

I risultati di precedenti studi di intervento hanno dato risultati promettenti indicando che alcune modifiche della dieta o dello stile di vita possono influenzare la progressione del cancro alla prostata, sebbene la maggior parte di questi studi sia stata di durata piuttosto breve e basata su un numero relativamente piccolo di pazienti. Ad esempio, uno studio randomizzato ha mostrato che gli uomini a cui era stata somministrata un'aggiunta dietetica di semi di lino avevano una percentuale inferiore di cellule positive contenenti il ​​marcatore di proliferazione Ki-67 rispetto agli uomini che non avevano ricevuto questa aggiunta alla loro dieta. Nel loro insieme, le prove attuali puntano verso la possibilità per i malati di cancro alla prostata di integrare con alternative terapeutiche legate allo stile di vita per prevenire o ritardare la progressione del tumore.

Obiettivo specifico: eseguire uno studio di intervento dietetico randomizzato controllato negli uomini con cancro alla prostata. Gli investigatori perseguiranno i seguenti obiettivi/ipotesi specifici:

1. "Tra gli uomini con carcinoma prostatico di livello di rischio intermedio, una dieta ricca di fitoestrogeni ridurrà la progressione del tumore rispetto agli uomini con una dieta povera di fitoestrogeni".
2. "Gli effetti di una dieta ricca di fitoestrogeni sulla progressione del tumore del cancro alla prostata differiscono tra gli uomini con diversi genotipi di polimorfismi nel gene ERß". Gli uomini saranno divisi in due sottogruppi, quelli portatori di alleli TT o TC/CC, del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) rs2987983-13950 T/C nel gene ERß, in cui l'ipotesi sarà verificata.
3. Per determinare se l'espressione dell'RNA di AR, ERα e ERβ nel tessuto tumorale della prostata, così come i livelli di ormoni steroidei, differiscono tra uomini con una dieta ricca e povera di fitoestrogeni, rispettivamente, o tra diversi genotipi del gene ERβ.
4. Per determinare se l'espressione dell'mRNA dei geni coinvolti nella proliferazione e nei percorsi del segnale ER analizzati mediante l'intero profilo trascrittomico nei campioni di prostatectomia differisce tra gli uomini con una dieta ricca e povera di fitoestrogeni, rispettivamente, o tra diversi genotipi del gene ERβ.

Protocollo di studio: attraverso i medici curanti, i ricercatori identificheranno 240 uomini nella regione sanitaria di Västra Götaland a cui è stato diagnosticato un cancro alla prostata di livello di rischio intermedio (T1-T2, punteggio di Gleason

Intervento: i pazienti verranno introdotti alla dieta di intervento da un dietologo e riceveranno informazioni generali sulle scelte alimentari sane (secondo le raccomandazioni per il pubblico in generale) e non mangiare integratori alimentari, non verranno fornite altre restrizioni dietetiche. Ai pazienti verrà consegnato un pacchetto contenente alimenti con un'elevata quantità di fitoestrogeni (≥100 mg di isoflavonoidi e ≥100 mg di lignani) da consumare quotidianamente. L'intervento continua fino al giorno prima dell'intervento (almeno 6 settimane). I pazienti del gruppo di controllo saranno informati allo stesso modo del gruppo di intervento, tranne per il fatto che non riceveranno alcun pacco alimentare.

Endpoint: l'effetto della dieta sul tasso di proliferazione tumorale sarà misurato confrontando 1) la percentuale di cellule positive contenenti il ​​marcatore Ki-67, 2) i livelli di PSA, 3) l'espressione di geni coinvolti nella proliferazione e nelle vie del segnale ER e Espressione genica della progressione del ciclo cellulare (CCP). Nelle immediate adiacenze dell'intervento, il chirurgo preleva quattro biopsie con ago mediano dal campione di prostata fresco, due dal sito del tumore e due dal tessuto prostatico sano, sulla base dei precedenti risultati delle biopsie diagnostiche e della risonanza magnetica. Anche presso l'ambulatorio , i tessuti della prostatectomia radicale vengono raccolti e fissati in formalina inclusi in paraffina. I campioni di sangue verranno prelevati all'inizio dello studio, il giorno prima dell'intervento, e inviati all'analisi del PSA (libero e totale). Verranno calcolate le differenze assolute nei livelli di PSA e il tempo di raddoppio del PSA. Inoltre, gli investigatori misureranno l'espressione di AR, ERα e ERß nel tessuto tumorale e i livelli ematici di ormoni, testosterone, DHT, estradiolo e 3ß-Adiol.

Questionario: tutti i pazienti risponderanno a un questionario protetto da password al basale, saranno misurati l'intervento chirurgico, il peso e l'altezza. Una volta durante il periodo di 6 settimane verrà eseguita un'intervista di richiamo di 24 ore, in cui verrà registrata l'assunzione di cibo da parte dei partecipanti durante le 24 ore precedenti. L'assunzione individuale di energia e nutrienti specifici sarà stimata collegando le informazioni dal questionario e dal registro dietetico al database nutrizionale della National Food Agency e al nostro database di fitoestrogeni precedentemente sviluppato. Le informazioni sul possibile uso di Finasteride, un inibitore della 5α-reduttasi, saranno raccolte dalle cartelle cliniche.

Analisi dei polimorfi: SNP nel gene ERß sarà analizzato in campioni di sangue, utilizzando il metodo PCR competitivo allele specifico PCR (KASP™). La costituzione dell'allele sarà identificata ei partecipanti saranno assegnati al gruppo TT, TC o CC. Analisi del Ki-67: Il campione bioptico viene fissato mediante immersione con paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M per 24 ore a +4°C. Quindi viene disidratato con etanolo graduato seguito da xilene e inclusione di paraffina. Le sezioni di paraffina vengono riscaldate per 30 minuti a 60ºC, pretrattate con tampone di acido citrico. Il legame aspecifico viene bloccato dal siero d'asino in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente Triton X-100 per 30 minuti. Incubazione con anticorpo Ki-67 durante la notte (4ºC) seguita da incubazione con l'appropriato anticorpo biotinilato secondario. Per migliorare il segnale, le sezioni vengono trattate con una soluzione di complesso avidina-biotina e per visualizzare l'immunoreattività viene utilizzata la diaminobenzidina (DAB). Le cellule tumorali colorate (positività al Ki-67) saranno contate e il risultato sarà riportato come rapporto di nuclei positivi diviso per il numero totale valutato × 100.

Analisi dell'espressione del recettore, del punteggio CCP, dei livelli ormonali e del PSA: i campioni di tessuto prelevati durante l'intervento chirurgico vengono successivamente inseriti nell'RNA prima di essere congelati. I campioni saranno analizzati utilizzando RNeasy plus Universal Mini Kits (QIAGEN) e reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR). L'espressione di ERα, ERβ e AR mRNA sarà determinata utilizzando il saggio TaqMan. L'RNA totale sarà estratto da sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina di tumori e tessuti benigni utilizzando l'array di espressione a livello di trascrittoma globale Clariom ™ D (Thermos Fischer). Per l'analisi del punteggio CCP, l'espressione genica dei geni coinvolti nel CCP basata rispettivamente sul pannello genico Prolaris® e sul Decipher Score. I livelli ematici di PSA saranno analizzati secondo il protocollo clinico standard.

Calcolo della potenza: nella regione sanitaria di Västra Götaland nel 2012, 321 uomini avevano un cancro alla prostata di livello di rischio intermedio per il quale hanno ricevuto un trattamento curativo. Il calcolo utilizzando l'esito primario (Ki-67) fornisce per un gruppo di studio composto da 118 pazienti una potenza dell'80 % per un test a due code con un livello di significatività pari a 0,05 e una dimensione dell'effetto pari a 0,5. I ricercatori hanno scoperto in studi precedenti che circa il 42% della popolazione maschile è eterozigote o omozigote per l'allele variante (TC/CC) della regione del promotore ERβ SNP (rs2987983-13950 T/C) e il 58% omozigote per l'allele wild type (TT). Poiché gli investigatori si aspettano che l'effetto dell'intervento sia maggiore tra i soggetti con l'allele variante, mentre minore tra i soggetti con l'allele wild type, quest'ultimo gruppo dovrebbe essere abbastanza grande da poter trovare una differenza se ne esiste una. Pertanto è necessaria una dimensione totale del campione di 118/58%=203 pazienti.

Considerazioni statistiche: gli investigatori utilizzeranno il metodo dell'intenzione di trattare. Nella progettazione e nella raccolta dei dati sono stati effettuati test sui farmaci come modello (randomizzazione, placebo, accecamento, nessun attrito, nessun errore di misurazione differenziale, analisi corretta); per le deviazioni dalla situazione perfetta i ricercatori utilizzano la teoria epidemiologica per guidare le analisi e interpretare i risultati. Verranno fornite analisi preliminari, basate su medie, mediane, deviazioni standard e range interquantile per descrivere correttamente i risultati di interesse e verrà eseguita la stratificazione per valutare le prestazioni della randomizzazione della dieta assegnata. Verranno quindi prodotti dei box-plot per valutare graficamente gli andamenti temporali della risposta. Verrà studiata la distribuzione degli esiti e, se necessario, verranno applicate opportune trasformazioni per migliorare la simmetria e la normalità. A causa della struttura longitudinale dei dati, verrà incorporata la correlazione tra le osservazioni e verranno eseguiti modelli di effetti misti lineari per studiare se (i) esiste una tendenza temporale (ii) se la tendenza lineare differisce tra individui trattati e non trattati (iii ) se l'effetto del trattamento tra il gruppo di intervento e il gruppo di controllo è modificato secondo i genotipi ERß, sia per il comune che per la variante. Un passaggio chiave nell'analisi dei dati longitudinali consiste nell'identificare la struttura di covarianza appropriata che descrive le correlazioni tra i punti dati: covarianza indipendente (nessuna correlazione), covarianza scambiabile (uguale correlazione) o covarianza autoregressiva con correlazione tra le risposte che diminuisce con il tempo tra le misurazioni. I ricercatori identificheranno la struttura più appropriata, verificata empiricamente con l'ausilio di un approccio teorico dell'informazione. Saranno prodotti sia test statistici che intervalli di confidenza per valutare la significatività degli effetti, saranno quindi utilizzate procedure di test F parziali per studiare l'effetto congiunto delle variabili principali e di interazione e verranno applicati metodi statistici appropriati per studiare l'adattamento del modello. L'associazione tra assunzione di fitoestrogeni e proliferazione tumorale sarà valutata mediante modelli lineari generalizzati, che forniranno stime della differenza di rischio (RD) e dei corrispondenti IC al 95%, stratificati per genotipi ERβ. Le interazioni tra l'assunzione di fitoestrogeni e gli SNP di ERβ sulla proliferazione saranno valutate considerando scale di effetti additivi. Il gruppo di assunzione di fitoestrogeni è incluso come variabile continua e ogni SNP è rappresentato da una variabile indicatore (variante o meno). L'interazione sarà valutata in un modello di probabilità lineare dal termine del prodotto tra le covariate che rappresentano l'assunzione di fitoestrogeni ei genotipi SNP.