Могут ли пищевые фитоэстрогены замедлить пролиферацию опухоли простаты? (PRODICA)

Данные экологических и экспериментальных исследований ясно показывают защитный эффект диетических фитоэстрогенов против рака предстательной железы. Генетические факторы также имеют этиологическое значение при раке предстательной железы, и появляется все больше доказательств важности взаимодействия генов и диеты в прогрессировании рака предстательной железы. Исследователи недавно обнаружили предполагаемое генетическое взаимодействие для этой защитной роли фитоэстрогенов. Общее снижение риска рака предстательной железы у мужчин при высоком потреблении фитоэстрогенов было сильно изменено вариантом нуклеотидной последовательности в гене бета-рецептора эстрогена (ERß). Американское исследование обнаружило аналогичный взаимодействующий эффект между приемом фитоэстрогенов, а также индексом массы тела (ИМТ) и другим вариантом нуклеотидной последовательности в ERß. содержится в сое и других бобах. Было обнаружено, что экспрессия ERß связана с прогрессированием рака предстательной железы, что позволяет предположить, что фитоэстрогены могут взаимодействовать с ERß при развитии рака предстательной железы. Что касается потенциальных канцерогенных механизмов, фитоэстрогены могут участвовать в эндокринном контроле роста клеток предстательной железы, влияя на баланс между AR и ERß. Тестостерон и его метаболит 5α-дигидротестостерон (ДГТ) вызывают пролиферацию эпителиальных клеток простаты посредством связывания с AR. Напротив, связываясь с ERβ, 5α-андростан-3β,17β-диол (3βAdiol), метаболит ДГТ, подавляет экспрессию AR и тем самым ингибирует андроген-зависимую пролиферацию, способствуя дифференцировке клеток. Что касается пролиферации, текущие данные предполагают комбинированную стимулирующую роль ERα и AR в простате, тогда как ERβ ингибирует пролиферацию и стимулирует дифференцировку. И эстроген ERα, и ß обладают сродством к эстрадиолу, тогда как фитоэстрогены и 3β-Адиол избирательно активируют ERß. В результате фитоэстрогены должны иметь возможность ограничивать рост рака, действуя в качестве заменителя 3ßAdiol. Это подтверждается экспериментальными исследованиями.

Результаты предыдущих интервенционных исследований дали многообещающие результаты, свидетельствующие о том, что определенные изменения в питании или образе жизни могут влиять на прогрессирование рака предстательной железы, хотя большинство этих исследований были довольно короткими и основаны на относительно небольшом числе пациентов. Например, рандомизированное исследование показало, что мужчины, которым давали диетическую добавку льняного семени, имели более низкий процент положительных клеток, содержащих маркер пролиферации Ki-67, чем мужчины, которые не получали эту добавку к своему рациону. Взятые вместе, настоящие данные указывают на возможность для пациентов с раком предстательной железы дополнять альтернативы лечения, связанные с образом жизни, для предотвращения или замедления прогрессирования опухоли.

Конкретная цель: провести контролируемое рандомизированное диетическое интервенционное исследование у мужчин с раком предстательной железы. Исследователи будут преследовать следующие конкретные цели/гипотезы:

1. «Среди мужчин с раком простаты промежуточного уровня риска диета с высоким содержанием фитоэстрогенов снизит прогрессирование опухоли по сравнению с мужчинами с диетой с низким содержанием фитоэстрогенов».
2. «Влияние диеты с высоким содержанием фитоэстрогенов на прогрессирование опухоли рака предстательной железы различается у мужчин с разными генотипами полиморфизма гена ERß». Мужчины будут разделены на две подгруппы, носители аллелей ТТ или ТС/СС однонуклеотидного полиморфизма (SNP) rs2987983-13950 T/C в гене ERß, на которых будет проверяться гипотеза.
3. Определить, различается ли экспрессия РНК AR, ERα и ERβ в ткани опухоли предстательной железы, а также уровни стероидных гормонов у мужчин с диетой с высоким и низким содержанием фитоэстрогенов соответственно или между разными генотипами гена ERβ.
4. Определить, различается ли экспрессия мРНК генов, участвующих в пролиферации и сигнальных путях ER, проанализированная с помощью полного транскриптомного профилирования в образцах после простатэктомии, у мужчин с диетой с высоким и низким содержанием фитоэстрогенов, соответственно, или между разными генотипами гена ERβ.

Протокол исследования: с помощью лечащих врачей исследователи выявят 240 мужчин в регионе здравоохранения Вестра-Гёталанд, у которых был диагностирован рак предстательной железы промежуточного уровня риска (T1-T2, шкала Глисона).

Вмешательство: пациенты будут ознакомлены с интервенционной диетой врачом-диетологом и получат общую информацию о выборе здоровой пищи (в соответствии с рекомендациями для широкой общественности) и о том, чтобы не употреблять какие-либо пищевые добавки, никаких других диетических ограничений не будет. Пациентам будет выдан пакет, содержащий продукты с высоким содержанием фитоэстрогенов (≥100 мг изофлавоноидов и ≥100 мг лигнанов), которые следует употреблять ежедневно. Вмешательство продолжается до дня, предшествующего операции (не менее 6 недель). Пациенты в контрольной группе будут проинформированы так же, как и в группе вмешательства, за исключением того, что они не получат никаких продуктовых наборов.

Конечная точка: влияние диеты на скорость пролиферации опухоли будет измеряться путем сравнения 1) процента положительных клеток, содержащих маркер Ki-67, 2) уровней ПСА, 3) экспрессии генов, участвующих в пролиферации и сигнальных путях ER, и экспрессия гена прогрессии клеточного цикла (CCP). В непосредственной близости от операции хирург берет четыре биоптата срединной иглой из свежего образца предстательной железы, два из участка опухоли и два из здоровой ткани предстательной железы, основываясь на предыдущих результатах диагностических биопсий и магнитно-резонансной томографии. Также во время операции , ткани радикальной простатэктомии собирают и заливают парафином, фиксированным формалином. Образцы крови будут взяты в начале исследования, за день до операции, и отправлены на анализ ПСА (свободный и общий). Будет рассчитана абсолютная разница уровней ПСА и время удвоения ПСА. Кроме того, исследователи будут измерять экспрессию AR, ERα и ERß в опухолевой ткани и уровень гормонов, тестостерона, ДГТ, эстрадиола и 3β-адиола в крови.

Анкета: Все пациенты будут отвечать на защищенный паролем вопросник на исходном уровне, будет измерена операция, вес и рост. Один раз в течение 6-недельного периода будет проведено 24-часовое интервью, в ходе которого будет зарегистрировано потребление пищи участниками в течение предшествующих 24 часов. Индивидуальное потребление энергии и конкретных питательных веществ будет оцениваться путем связывания информации из анкеты и записи о диете с базой данных о питании Национального агентства по продовольствию и нашей ранее разработанной базой данных по фитоэстрогенам. Информация о возможном применении финастерида, ингибитора 5α-редуктазы, будет получена из медицинских карт.

Анализ полиморфов: SNP в ERß-гене будет проанализирован в образцах крови с использованием основанного на ПЦР метода конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASP™). Аллель-конституция будет определена, и участники будут отнесены к группе ТТ, ТС или СС. Анализ Ki-67: Биоптат фиксируют погружением в 4 % параформальдегид в 0,1 М фосфатном буфере в течение 24 часов при +4°С. Затем его обезвоживают этанолом с последующей заливкой ксилолом и парафином. Парафиновые срезы прогревают в течение 30 мин при 60°С, предварительно обрабатывая лимоннокислым буфером. Неспецифическое связывание блокируется ослиной сывороткой в ​​фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащей Triton X-100, в течение 30 минут. Инкубация с антителом Ki-67 в течение ночи (4ºC) с последующей инкубацией с соответствующим вторичным биотинилированным антителом. Для усиления сигнала срезы обрабатывают раствором авидин-биотинового комплекса, а для визуализации иммунореактивности используют диаминобензидин (ДАБ). Окрашенные опухолевые клетки (положительные Ki-67) будут подсчитаны, и результат будет представлен как отношение положительных ядер, деленное на общее оцененное количество × 100.

Анализ экспрессии рецепторов, оценка CCP, уровни гормонов и ПСА: Образцы тканей, взятые во время операции, помещают в РНК-позже перед замораживанием. Образцы будут проанализированы с использованием универсальных мини-наборов RNeasy plus (QIAGEN) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Экспрессию мРНК ERα, ERβ и AR определят с помощью анализа TaqMan. Суммарная РНК будет извлечена из фиксированных формалином и залитых парафином срезов опухолей и доброкачественных тканей с использованием экспрессионного массива для всего транскриптома Clariom ™ D (Thermos Fischer). Для анализа оценки CCP экспрессия генов, участвующих в CCP, основана на панели генов Prolaris® и шкале расшифровки соответственно. Уровни ПСА в крови будут проанализированы в соответствии со стандартным клиническим протоколом.

Расчет мощности: в регионе здравоохранения Вестра-Гёталанд в 2012 г. у 321 мужчины был рак предстательной железы промежуточного уровня риска, по поводу которого они получали радикальное лечение. Расчет с использованием первичного исхода (Ki-67) дает для исследовательской группы, состоящей из 118 пациентов, мощность 80 % для двустороннего теста с уровнем значимости 0,05 и величиной эффекта 0,5. В более ранних исследованиях исследователи обнаружили, что примерно 42 % мужского населения являются гетерозиготными или гомозиготными по вариантному аллелю (TC/CC) SNP области промотора ERβ (rs2987983-13950 T/C) и 58 % гомозиготны по аллелю дикого типа. (ТТ). Поскольку исследователи ожидают, что эффект от вмешательства будет выше у субъектов с вариантным аллелем и меньше у субъектов с аллелем дикого типа, эта последняя группа должна быть достаточно большой, чтобы иметь возможность найти разницу, если она существует. Таким образом, необходим общий размер выборки 118/58%=203 пациента.

Статистические соображения. Исследователи будут использовать метод намерения лечить. При разработке и сборе данных были проведены испытания препаратов в качестве шаблона (рандомизация, плацебо, слепое исследование, отсутствие истощения, отсутствие дифференциальных ошибок измерения, правильный анализ); для отклонений от идеальной ситуации исследователи используют эпидемиологическую теорию для руководства анализами и интерпретации результатов. Предварительный анализ, основанный на средних значениях, медианах, стандартных отклонениях и межквантильном диапазоне, будет предоставлен для правильного описания интересующих результатов, а стратификация будет выполнена для оценки эффективности рандомизации назначенной диеты. Таким образом, для графической оценки временных тенденций отклика будут построены ящичные диаграммы. Распределение результатов будет изучено, и при необходимости будут применены соответствующие преобразования для улучшения симметрии и нормальности. Из-за лонгитудинальной структуры данных будет включена корреляция между наблюдениями, и будут проведены линейные модели смешанных эффектов для изучения того, (i) существует ли временная тенденция (ii) отличается ли линейная тенденция между леченными и нелеченными людьми (iii ) если эффект лечения между группой вмешательства и контрольной группой изменяется в соответствии с генотипами ERß, как для обычного, так и для варианта. Ключевым шагом в анализе лонгитюдных данных является определение соответствующей ковариационной структуры, которая описывает корреляции между точками данных: независимая ковариация (отсутствие корреляции), обменная ковариация (равная корреляция) или авторегрессионная ковариация с корреляцией между ответами, уменьшающейся со временем между измерениями. Исследователи определят наиболее подходящую структуру, проверенную эмпирически с помощью теоретико-информационного подхода. Для оценки значимости эффектов будут произведены как статистические тесты, так и доверительные интервалы, поэтому процедуры частичного F-теста будут использоваться для изучения совместного эффекта основных переменных и переменных взаимодействия, а соответствующие статистические методы будут применяться для изучения подбора модели. Связь между потреблением фитоэстрогенов и пролиферацией рака будет оцениваться с помощью обобщенных линейных моделей, которые обеспечат оценки разности рисков (RD) и соответствующих 95% CI, стратифицированных по генотипам ERβ. Взаимодействия между потреблением фитоэстрогенов и SNP ERβ на пролиферацию будут оцениваться с учетом шкал аддитивного эффекта. Группа потребления фитоэстрогенов включена как непрерывная переменная, а каждый SNP представлен индикаторной переменной (вариант или нет). Взаимодействие будет оцениваться в линейной модели шансов по продукту между ковариатами, представляющими потребление фитоэстрогенов и генотипы SNP.