Kan dietära fytoöstrogener bromsa prostatatumörproliferation? (PRODICA)

Data från ekologiska och experimentella studier visar tydligt en skyddande effekt av fytoöstrogener i kosten mot prostatacancer. Genetiska faktorer är också av etiologisk betydelse vid prostatacancer och det finns växande bevis för vikten av en gen-diet-interaktion i prostatacancerprogression. Utredarna har nyligen funnit en förmodad genetisk interaktion för denna skyddande roll för fytoöstrogener. Den totalt sett minskade risken för prostatacancer hos män med högt intag av fytoöstrogener modifierades kraftigt av en nukleotidsekvensvariant i östrogenreceptor-beta-genen (ERß). En amerikansk studie fann en liknande interaktiv effekt mellan intag av fytoöstrogener, såväl som body mass index (BMI), och en annan nukleotidsekvensvariant i ERß. Fytoöstrogener isoflavonoider och coumestan binder hårt till östrogenreceptorn-beta (ERß) och är främst finns i soja och andra bönor. ERß-uttryck har visat sig vara involverat i progression av prostatacancer, vilket tyder på att fytoöstrogener kan interagera med ERß i utvecklingen av prostatacancer. När det gäller potentiella cancerframkallande mekanismer kan fytoöstrogener vara involverade i den endokrina kontrollen av prostatacelltillväxt genom att påverka balansen mellan AR och ERß. Testosteron och dess metabolit 5α-dihydrotestosteron (DHT) orsakar proliferation av prostataepitelceller genom bindning till AR. Däremot, genom att binda till ERß, undertrycker 5α androstan-3ß,17ß-diol (3ßAdiol), en metabolit av DHT, uttrycket av AR och hämmar därigenom androgendriven proliferation samtidigt som det främjar celldifferentiering. När det gäller proliferation, tyder nuvarande data på en kombinerad stimulerande roll för ERα och AR i prostatan medan ERß hämmar proliferation och stimulerar differentiering. Både östrogen ERα och ß har affinitet för östradiol medan fytoöstrogener och 3ßAdiol selektivt aktiverar ERß. Fytoöstrogener bör, som ett resultat, kunna begränsa cancertillväxten genom att fungera som ett substitut för 3ßAdiol. Detta bekräftas av experimentella studier.

Resultat från tidigare interventionsstudier har gett lovande resultat som tyder på att vissa kost- eller livsstilsförändringar kan påverka utvecklingen av prostatacancer, även om de flesta av dessa studier har varit ganska korta och baserade på ett relativt litet antal patienter. Till exempel visade en randomiserad studie att män som fick ett kosttillskott av linfrön hade en lägre andel positiva celler som innehöll spridningsmarkören Ki-67 än män som inte hade fått detta tillskott i kosten. Sammantaget pekar föreliggande bevis på möjligheten för prostatacancerpatienter att komplettera med livsstilsrelaterade behandlingsalternativ för att förhindra eller fördröja tumörprogression.

Specifikt syfte: Att utföra en kontrollerad randomiserad kostinterventionsstudie på män med prostatacancer. Utredarna kommer att eftersträva följande specifika syften/hypotes:

1. "Bland män med prostatacancer av medelrisknivå kommer en diet med hög fytoöstrogener att minska tumörprogressionen jämfört med män med en diet med låg fytoöstrogener".
2. "Effekterna av en kost rik på fytoöstrogener på prostatacancertumörprogression skiljer sig mellan män med olika genotyper av polymorfismer i ERß-genen". Männen kommer att delas in i två undergrupper, de som bär TT- eller TC/CC-alleler, av singelnukleotidpolymorfismen (SNP) rs2987983-13950 T/C i ERß-genen, där hypotesen kommer att testas.
3. För att avgöra om RNA-uttryck av AR, ERα och ERβ i prostatatumörvävnad, såväl som nivåer av steroidhormoner, skiljer sig mellan män med en diet med hög respektive låg fytoöstrogener, eller mellan olika genotyper av ERβ-genen.
4. För att avgöra om mRNA-uttryck av gener involverade i proliferation och ER-signalvägar analyserade genom hel transkriptomisk profilering i prostatektomiprover skiljer sig mellan män med en diet hög respektive låg i fytoöstrogener, eller mellan olika genotyper av ERβ-genen.

Studieprotokoll: Genom behandlande läkare kommer utredarna att identifiera 240 män i Västra Götalands sjukvårdsregion som har diagnostiserats med prostatacancer av medelrisknivå (T1-T2, Gleason-poäng).

Intervention: Patienterna kommer att introduceras till interventionsdieten av en dietist och kommer att få allmän information om hälsosamma matval (enligt rekommendationer för allmänheten) och att inte äta några kosttillskott, inga andra kostrestriktioner kommer att ges. Patienterna kommer att få ett paket innehållande mat med en hög mängd fytoöstrogener (≥100 mg isoflavonoider och ≥100 mg lignaner) som ska konsumeras dagligen. Ingreppet pågår till dagen före operationen (minst 6 veckor). Patienterna i kontrollgruppen kommer att informeras på samma sätt som interventionsgruppen förutom att de inte kommer att få något matpaket.

Endpoint: Effekten av kosten på tumörproliferationshastigheten kommer att mätas genom att göra jämförelser av 1) procentandel positiva celler som innehåller markören Ki-67, 2) PSA-nivåer, 3) uttryck av gener involverade i proliferation och ER-signalvägar och cellcykelprogression (CCP) genuttryck. I omedelbar anslutning till operationen samlar kirurgen in fyra mediannålsbiopsier från det färska prostataprovet, två från tumörstället och två från frisk prostatavävnad, baserat på tidigare resultat från de diagnostiska biopsierna och magnetisk resonanstomografi. Även vid operationen. vävnaderna från radikal prostatektomi samlas upp och formalinfixerad paraffin bäddas in. Blodprov kommer att tas i början av studien, dagen före operationen, och skickas till analys av PSA (gratis och totalt). De absoluta skillnaderna i PSA-nivåer och PSA-fördubblingstiden kommer att beräknas. Dessutom kommer utredarna att mäta uttrycket av AR, ERα och ERß i tumörvävnad och blodnivåerna av hormoner, testosteron, DHT, estradiol och 3ß-Adiol.

Frågeformulär: Alla patienter kommer att svara på ett lösenordsskyddat frågeformulär vid baslinjen, operation, vikt och längd kommer att mätas. En gång under 6-veckorsperioden kommer en 24-timmars återkallelseintervju att genomföras, där deltagarnas matintag under de föregående 24 timmarna kommer att registreras. Det individuella intaget av energi och specifika näringsämnen kommer att uppskattas genom att länka information från frågeformulär och kostjournal till Livsmedelsverkets näringsdatabas och vår tidigare utvecklade fytoöstrogendatabas. Information om möjlig användning av Finasteride, en 5α-reduktashämmare, kommer att samlas in från medicinska journaler.

Analys av polymorfer:SNP i ERß-genen kommer att analyseras i blodprover, med hjälp av den PCR-baserade metoden kompetitiv allelspecifik PCR (KASP™). Allelkonstitutionen kommer att identifieras och deltagare kommer att tilldelas grupp TT, TC eller CC. Analys av Ki-67: Biopsiprovet fixeras genom nedsänkning med 4 % paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert under 24 timmar vid +4°C. Därefter dehydreras den med graderad etanol följt av xylen och paraffininbäddning. Paraffinsektioner värms i 30 minuter vid 60ºC, förbehandlas med citronsyrabuffert. Ospecifik bindning blockeras av åsneserum i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande Triton X-100 under 30 minuter. Inkubering med Ki-67-antikropp över natten (4ºC) följt av inkubation med lämplig sekundär biotinylerad antikropp. För att förstärka signalen behandlas sektionerna med avidin-biotin-komplexlösning och för att visualisera immunreaktiviteten används Diaminobenzidin (DAB). Färgade tumörceller (Ki-67 positivitet) kommer att räknas och resultatet kommer att rapporteras som förhållandet mellan positiva kärnor dividerat med det totala antalet utvärderade × 100.

Analys av receptoruttryck, CCP-poäng, hormonnivåer och PSA: Vävnadsprover som tas vid operationen placeras i RNA-senare innan de fryses. Proverna kommer att analyseras med RNeasy plus Universal Mini Kits (QIAGEN) och realtidspolymeraskedjereaktion (PCR). ERα-, ERβ- och AR-mRNA-uttryck kommer att bestämmas med hjälp av TaqMan-analys. Totalt RNA kommer att extraheras från formalinfixerade paraffininbäddade sektioner av tumörer och benigna vävnader med användning av den globala transkriptomomfattande expressionsmatrisen Clariom™ D (Thermos Fischer). För analys av CCP-poängen, genuttryck av generna involverade i CCP baserat på Prolaris®-genpanelen respektive Decipher Score. PSA-blodnivåer kommer att analyseras enligt kliniskt standardprotokoll.

Effektberäkning: I Västra Götalands sjukvårdsregion 2012 hade 321 män medelrisk prostatacancer som de fick botande behandling för. Beräkning med det primära utfallet (Ki-67) ger för en studiegrupp bestående av 118 patienter 80 % effekt för ett dubbelsidigt test med signifikansnivån 0,05 och effektstorleken 0,5. Utredarna fann i tidigare studier att cirka 42 % av den manliga populationen är heterozygot eller homozygot för variantallelen (TC/CC) av ERβ-promotorregionen SNP (rs2987983-13950 T/C) och 58 % homozygota för vildtypsallelen (TT). Eftersom utredarna förväntar sig att effekten av interventionen är större bland försökspersoner med variantallelen, medan mindre bland försökspersoner med vildtypsallelen, borde denna senare grupp vara tillräckligt stor för att kunna hitta en skillnad om en sådan existerar. Således behövs en total provstorlek på 118/58%=203 patienter.

Statistiska överväganden: Utredarna kommer att använda intention-to-treat-metoden. Vid design och datainsamling har testning av läkemedel som mall gjorts (randomisering, placebo, blindning, ingen förslitning, inga differentiella mätfel, korrekt analys); för avvikelserna från den perfekta situationen använder utredarna epidemiologisk teori för att styra analyserna och tolka resultaten. Preliminära analyser, baserade på medelvärden, medianer, standardavvikelser och interkvantilt intervall kommer att tillhandahållas för att korrekt beskriva resultaten av intresse och stratifiering kommer att utföras för att bedöma prestandan av randomiseringen av den tilldelade kosten. Box-plots kommer därför att tas fram för att grafiskt utvärdera de tidsmässiga trenderna i responsen. Fördelningen av resultaten kommer att studeras och lämpliga transformationer kommer att tillämpas, vid behov, för att förbättra symmetri och normalitet. På grund av den longitudinella strukturen av data kommer korrelation mellan observationer att införlivas och linjära blandade effektmodeller kommer att utföras för att studera om (i) det finns en tidsmässig trend (ii) om den linjära trenden skiljer sig mellan behandlade och obehandlade individer (iii) ) om behandlingseffekten mellan interventionsgruppen och kontrollgruppen modifieras enligt ERß-genotyper, både för den vanliga och för varianten. Ett nyckelsteg i analys av longitudinella data är att identifiera den lämpliga kovariansstrukturen som beskriver korrelationerna mellan datapunkterna: oberoende kovarians (ingen korrelation), utbytbar kovarians (lika korrelation) eller autoregressiv kovarians med korrelation mellan svar som minskar med tiden mellan mätningarna. Utredarna kommer att identifiera den lämpligaste strukturen, verifierad empiriskt med hjälp av en informationsteoretisk ansats. Både statistiska tester och konfidensintervall kommer att tas fram för att bedöma betydelsen av effekterna, partiella F-testprocedurer kommer därför att användas för att studera den sammanslagna effekten av huvud- och interaktionsvariabler och lämpliga statistiska metoder kommer att tillämpas för att studera modellanpassning. Sambandet mellan intag av fytoöstrogener och cancerproliferation kommer att utvärderas med generaliserade linjära modeller, som kommer att ge uppskattningar av riskskillnaden (RDs) och motsvarande 95% CI, stratifierade av ERβ-genotyper. Interaktioner mellan fytoöstrogenintag och ERβ SNPs på proliferation kommer att utvärderas med hänsyn till skalor för additiv effekt. Grupp av fytoöstrogenintag ingår som en kontinuerlig variabel, och varje SNP representeras av en indikatorvariabel (variant eller inte). Interaktion kommer att bedömas i en linjär oddsmodell av produkttermen mellan de kovariater som representerar fytoöstrogenintag och SNP-genotyper.