Kan diætetiske fytoøstrogener bremse prostatatumorproliferation? (PRODICA)

Data fra økologiske og eksperimentelle undersøgelser viser tydeligt en beskyttende effekt af diætetiske fytoøstrogener mod prostatacancer. Genetiske faktorer er også af ætiologisk betydning ved prostatacancer, og der er voksende beviser for vigtigheden af ​​en gen-diæt-interaktion i prostatacancerprogression. Efterforskerne har for nylig fundet en formodet genetisk interaktion for denne beskyttende rolle af phytoøstrogener. Den samlede reducerede risiko for prostatacancer hos mænd med et højt indtag af fytoøstrogener var stærkt modificeret af en nukleotidsekvensvariant i østrogenreceptor-beta-genet (ERß). En amerikansk undersøgelse fandt en lignende interaktiv effekt mellem indtag af phytoøstrogener, samt body mass index (BMI), og en anden nukleotidsekvensvariant i ERß. Fytoøstrogenerne isoflavonoider og coumestan binder sig tæt til østrogenreceptoren-beta (ERß) og er hovedsageligt findes i soja og andre bønner. ERß-ekspression har vist sig at være involveret i progression af prostatacancer, hvilket tyder på, at phytoøstrogener kan interagere med ERß i udviklingen af ​​prostatacancer. Med hensyn til potentielle kræftfremkaldende mekanismer kan phytoøstrogener være involveret i den endokrine kontrol af prostatacellevækst ved at påvirke balancen mellem AR og ERß. Testosteron og dets metabolit 5α-dihydrotestosteron (DHT) forårsager proliferation af prostata epitelceller gennem binding til AR. I modsætning hertil undertrykker 5α androstane-3ß,17ß-diol (3ßAdiol), en metabolit af DHT, ekspressionen af ​​AR ved at binde sig til ERß og ​​hæmmer derved androgen-drevet proliferation, mens det fremmer celledifferentiering. Med hensyn til spredning antyder nuværende data en kombineret stimulerende rolle af ERα og AR i prostata, hvorimod ERß hæmmer spredning og stimulerer differentiering. Både østrogen ERα og ß har affinitet til østradiol, hvorimod phytoøstrogener og 3ßAdiol selektivt aktiverer ERß. Fytoøstrogener bør som følge heraf være i stand til at begrænse kræftvækst ved at fungere som en erstatning for 3ßAdiol. Dette bekræftes af eksperimentelle undersøgelser.

Resultater fra tidligere interventionsundersøgelser har givet lovende resultater, der indikerer, at visse kost- eller livsstilsændringer kan påvirke udviklingen af ​​prostatacancer, selvom de fleste af disse undersøgelser har været af forholdsvis kort varighed og baseret på et relativt lille antal patienter. For eksempel viste en randomiseret undersøgelse, at mænd, der fik et kosttilskud af hørfrø, havde en lavere procentdel af positive celler, der indeholdt spredningsmarkøren Ki-67, end mænd, der ikke havde fået denne tilsætning til deres kost. Samlet peger den foreliggende evidens mod muligheden for, at prostatacancerpatienter kan supplere med livsstilsrelaterede behandlingsalternativer for at forhindre eller forsinke tumorprogression.

Specifikt mål: At udføre et kontrolleret randomiseret kostinterventionsstudie hos mænd med prostatacancer. Efterforskerne vil forfølge følgende specifikke mål/hypotese:

1. "Blandt mænd med prostatacancer på mellemrisikoniveau vil en diæt med højt indhold af fytoøstrogener reducere tumorprogression sammenlignet med mænd med en diæt med lavt indhold af fytoøstrogener".
2. "Effekterne af en kost med højt indhold af fytoøstrogener på prostatacancertumorprogression er forskellige mellem mænd med forskellige genotyper af polymorfismer i ERß-genet". Mændene vil blive opdelt i to undergrupper, dem der bærer TT- eller TC/CC-alleler, af single-nucleotid polymorphism (SNP) rs2987983-13950 T/C i ERß-genet, hvor hypotesen vil blive testet.
3. For at bestemme, om RNA-ekspression af AR, ERα og ERβ i prostatatumorvæv, såvel som niveauer af steroidhormoner, adskiller sig mellem mænd med en diæt med henholdsvis høj og lav phytoøstrogener eller mellem forskellige genotyper af ERβ-genet.
4. For at bestemme, om mRNA-ekspression af gener involveret i proliferation og ER-signalveje analyseret ved hel transkriptomisk profilering i prostatektomiprøver adskiller sig mellem mænd med en diæt med henholdsvis højt og lavt indhold af fytoøstrogener eller mellem forskellige genotyper af ERβ-genet.

Undersøgelsesprotokol: Gennem behandlende læger vil efterforskerne identificere 240 mænd i Västra Götalands sundhedsregion, som er blevet diagnosticeret med prostatacancer på mellemrisikoniveau (T1-T2, Gleason score

Intervention: Patienter vil blive introduceret til interventionsdiæten af ​​en diætist og vil modtage generel information om sunde madvalg (ifølge anbefalinger til den brede offentlighed) og om ikke at spise kosttilskud, der vil ikke blive givet andre diætrestriktioner. Patienterne får udleveret en pakke indeholdende mad med en høj mængde fytoøstrogener (≥100 mg isoflavonoider og ≥100 mg lignaner), som skal indtages dagligt. Indgrebet fortsætter indtil dagen før operationen (mindst 6 uger). Patienterne i kontrolgruppen vil blive informeret på samme måde som interventionsgruppen bortset fra, at de ikke modtager nogen madpakke.

Endpoint: Diætens effekt på tumorproliferationshastigheden vil blive målt ved at sammenligne 1) procentdelen af ​​positive celler, der indeholder markøren Ki-67, 2) PSA-niveauer, 3) ekspression af gener involveret i proliferation og ER-signalveje og cellecyklusprogression (CCP) genekspression. I umiddelbar tilknytning til operationen indsamler kirurgen fire median-nålebiopsier fra den friske prostataprøve, to fra tumorstedet og to fra sundt prostatavæv, baseret på tidligere resultater fra de diagnostiske biopsier og magnetisk resonansbilleddannelse. Også ved operationen , opsamles de radikale prostatektomivæv og formalinfikseret paraffin indlejret. Blodprøver tages i begyndelsen af ​​undersøgelsen, dagen før operationen, og sendes til analyse af PSA (gratis og total). De absolutte forskelle i PSA-niveauer og PSA-fordoblingstiden vil blive beregnet. Derudover vil efterforskerne måle ekspressionen af ​​AR, ERα og ERß i tumorvæv og blodniveauerne af hormoner, testosteron, DHT, østradiol og 3ß-Adiol.

Spørgeskema: Alle patienter vil besvare et password-beskyttet spørgeskema ved baseline, operation, vægt og højde vil blive målt. Én gang i løbet af 6-ugers perioden vil der blive udført et 24-timers tilbagekaldelsesinterview, hvor deltagernes fødeindtagelse i løbet af de foregående 24 timer vil blive registreret. Det individuelle indtag af energi og specifikke næringsstoffer vil blive estimeret ved at koble oplysninger fra spørgeskema og kostjournal til Fødevarestyrelsens ernæringsdatabase og vores tidligere udviklede planteøstrogendatabase. Oplysninger om mulig brug af Finasteride, en 5α-reduktasehæmmer, vil blive indsamlet fra lægejournaler.

Analyse af polymorfer:SNP i ERß-genet vil blive analyseret i blodprøver ved hjælp af den PCR-baserede metode, kompetitiv allelspecifik PCR (KASP™). Allel-sammensætningen vil blive identificeret, og deltagere vil blive tildelt gruppe TT, TC eller CC. Analyse af Ki-67: Biopsiprøven fikseres ved nedsænkning med 4 % paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer i 24 timer ved +4°C. Derefter dehydreres det med graderet ethanol efterfulgt af xylen og paraffinindstøbning. Paraffinsektioner opvarmes i 30 minutter ved 60ºC, forbehandles med citronsyrebuffer. Uspecifik binding blokeres af æselserum i phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende Triton X-100 i 30 minutter. Inkubering med Ki-67 antistof natten over (4ºC) efterfulgt af inkubation med det passende sekundære biotinylerede antistof. For at forstærke signalet behandles snittene med avidin-biotin-kompleks opløsning, og for at visualisere immunreaktiviteten anvendes Diaminobenzidin (DAB). Farvede tumorceller (Ki-67-positivitet) vil blive talt, og resultatet vil blive rapporteret som forholdet mellem positive kerner divideret med det samlede antal vurderet × 100.

Analyse af receptor-ekspression, CCP-score, hormonniveauer og PSA: Vævsprøver taget ved operationen placeres i RNA-senere før de fryses. Prøverne vil blive analyseret ved hjælp af RNeasy plus Universal Mini Kits (QIAGEN) og Real-time polymerase chain reaction (PCR). ERα-, ERβ- og AR-mRNA-ekspression vil blive bestemt ved hjælp af TaqMan-assay. Totalt RNA vil blive ekstraheret fra formalinfikserede paraffinindlejrede sektioner af tumorer og benigne væv ved hjælp af det globale transkriptom-omfattende ekspressionsarray Clariom™ D (Thermos Fischer). Til analyse af CCP-score, genekspression af generne involveret i CCP baseret på henholdsvis Prolaris®-genpanelet og Decipher Score. PSA-blodniveauer vil blive analyseret i henhold til standard klinisk protokol.

Styrkeberegning: I Västra Götalands sundhedsregion havde 321 mænd i 2012 prostatacancer på mellemrisikoniveau, som de modtog helbredende behandling for. Beregning med det primære udfald (Ki-67) giver for en undersøgelsesgruppe bestående af 118 patienter 80 % power for en tosidet test med et signifikansniveau på 0,05 og effektstørrelse på 0,5. Forskerne fandt i tidligere undersøgelser, at ca. 42 % af den mandlige population er heterozygot eller homozygot for variantallelen (TC/CC) af ERβ-promotorregionen SNP (rs2987983-13950 T/C) og 58 % homozygot for vildtype-allelen (TT). Da efterforskerne forventer, at effekten af ​​interventionen er større blandt forsøgspersoner med variantallelen, mens mindre blandt forsøgspersoner med vildtype-allelen, burde denne sidstnævnte gruppe være stor nok til at kunne finde en forskel, hvis en sådan eksisterer. Der er således behov for en samlet stikprøvestørrelse på 118/58%=203 patienter.

Statistiske overvejelser: Efterforskerne vil bruge intention-to-treat-metoden. I design og dataindsamling er der lavet test af lægemidler som skabelonen (randomisering, placebo, blinding, ingen nedslidning, ingen differentielle målefejl, korrekt analyse); for afvigelserne fra den perfekte situation bruger efterforskerne epidemiologisk teori til at vejlede analyserne og fortolke resultaterne. Foreløbige analyser, baseret på middelværdier, medianer, standardafvigelser og interkvantilt område vil blive leveret til korrekt beskrivelse af resultaterne af interesse, og stratificering vil blive udført for at vurdere ydeevnen af ​​randomiseringen af ​​den tildelte diæt. Box-plot vil derfor blive produceret til grafisk at vurdere de tidsmæssige tendenser i responsen. Fordelingen af ​​resultaterne vil blive undersøgt, og passende transformationer vil blive anvendt, hvis det er nødvendigt, for at forbedre symmetri og normalitet. På grund af dataenes longitudinelle struktur vil korrelation mellem observationer blive inkorporeret, og lineære mixed effects-modeller vil blive udført for at undersøge, om (i) der er en tidsmæssig tendens (ii), hvis den lineære tendens er forskellig mellem behandlede og ubehandlede individer (iii) ) hvis behandlingseffekten mellem interventionsgruppen og kontrolgruppen modificeres efter ERß genotyper, både for den almindelige og varianten. Et nøgletrin i analyse af longitudinelle data er at identificere den passende kovariansstruktur, der beskriver korrelationerne mellem datapunkterne: uafhængig kovarians (ingen korrelation), udskiftelig kovarians (lige korrelation) eller autoregressiv kovarians med korrelation mellem svar, der falder med tiden mellem målinger. Efterforskerne vil identificere den mest passende struktur, verificeret empirisk ved hjælp af en informationsteoretisk tilgang. Både statistiske test og konfidensintervaller vil blive produceret for at vurdere betydningen af ​​effekterne, partielle F-testprocedurer vil derfor blive brugt til at studere den samlede effekt af hoved- og interaktionsvariabler og passende statistiske metoder vil blive anvendt til at studere modeltilpasning. Forbindelsen mellem phytoøstrogenerindtagelse og cancerproliferation vil blive evalueret ved hjælp af generaliserede lineære modeller, som vil give estimater af risikoforskellen (RD'er) og tilsvarende 95% CI'er, stratificeret efter ERβ-genotyper. Interaktioner mellem phytoøstrogenindtag og ERβ SNP'er på spredning vil blive evalueret under hensyntagen til additive effektskalaer. Gruppe af fytoøstrogenindtag er inkluderet som en kontinuerlig variabel, og hver SNP er repræsenteret af en indikatorvariabel (variant eller ej). Interaktion vil blive vurderet i en lineær oddsmodel ved produkttermen mellem de kovariater, der repræsenterer phytoøstrogenindtag og SNP-genotyper.