Kan kostholdsfytoøstrogener bremse spredning av prostatasvulster? (PRODICA)

Data fra økologiske og eksperimentelle studier viser tydelig en beskyttende effekt av fytoøstrogener i kosten mot prostatakreft. Genetiske faktorer er også av etiologisk betydning ved prostatakreft, og det er økende bevis for viktigheten av en gen-diett-interaksjon i prostatakreftprogresjon. Etterforskerne har nylig funnet en antatt genetisk interaksjon for denne beskyttende rollen til fytoøstrogener. Den generelle reduserte risikoen for prostatakreft hos menn med høyt inntak av fytoøstrogener ble sterkt modifisert av en nukleotidsekvensvariant i østrogenreseptor-beta-genet (ERß). En amerikansk studie fant en lignende interaktiv effekt mellom inntak av fytoøstrogener, samt kroppsmasseindeks (BMI), og en annen nukleotidsekvensvariant i ERß. Fytoøstrogenene isoflavonoider og coumestan binder seg tett til østrogenreseptoren-beta (ERß) og er hovedsakelig finnes i soya og andre bønner. ERß-uttrykk har vist seg å være involvert i progresjon av prostatakreft, noe som tyder på at fytoøstrogener kan samhandle med ERß i utviklingen av prostatakreft. Med hensyn til potensielle kreftfremkallende mekanismer kan fytoøstrogener være involvert i den endokrine kontrollen av prostatacellevekst ved å påvirke balansen mellom AR og ERß. Testosteron og dets metabolitt 5α-dihydrotestosteron (DHT) forårsaker spredning av prostataepitelceller gjennom binding til AR. I kontrast, ved å binde seg til ERß, undertrykker 5α androstane-3ß,17ß-diol (3ßAdiol), en metabolitt av DHT, uttrykket av AR og hemmer derved androgendrevet spredning samtidig som det fremmer celledifferensiering. Når det gjelder spredning, tyder nåværende data på en kombinert stimulerende rolle for ERα og AR i prostata, mens ERß hemmer spredning og stimulerer differensiering. Både østrogen ERα og ß har affinitet for østradiol, mens fytoøstrogener og 3ßAdiol selektivt aktiverer ERß. Fytoøstrogener bør som et resultat kunne begrense kreftveksten ved å fungere som en erstatning for 3ßAdiol. Dette bekreftes av eksperimentelle studier.

Resultater fra tidligere intervensjonsstudier har gitt lovende resultater som indikerer at visse kostholds- eller livsstilsendringer kan påvirke progresjonen av prostatakreft, selv om de fleste av disse studiene har vært av ganske kort varighet og basert på relativt lite antall pasienter. For eksempel viste en randomisert studie at menn som fikk et kosttilskudd av linfrø hadde en lavere prosentandel positive celler som inneholdt spredningsmarkøren Ki-67 enn menn som ikke hadde fått dette tillegget til kostholdet. Samlet peker nåværende bevis mot muligheten for prostatakreftpasienter å komplementere med livsstilsrelaterte behandlingsalternativer for å forhindre eller forsinke tumorprogresjon.

Spesifikt mål: Å utføre en kontrollert randomisert diettintervensjonsstudie hos menn med prostatakreft. Etterforskerne vil forfølge følgende spesifikke mål/hypotese:

1. "Blant menn med prostatakreft med middels risikonivå, vil en diett med mye fytoøstrogener redusere tumorprogresjon sammenlignet med menn med en diett lav i fytoøstrogener."
2. "Effektene av en diett høy i fytoøstrogener på prostatakrefttumorprogresjon er forskjellig mellom menn med forskjellige genotyper av polymorfismer i ERß-genet". Mennene vil bli delt inn i to undergrupper, de som har TT- eller TC/CC-alleler, av single-nucleotide polymorphism (SNP) rs2987983-13950 T/C i ERß-genet, hvor hypotesen vil bli testet.
3. For å bestemme om RNA-ekspresjon av AR, ERα og ERβ i prostatasvulstvev, samt nivåer av steroidhormoner, er forskjellig mellom menn med en diett med henholdsvis høyt og lavt fytoøstrogener, eller mellom ulike genotyper av ERβ-genet.
4. For å bestemme om mRNA-ekspresjon av gener involvert i proliferasjon og ER-signalveier analysert ved hel transkriptomisk profilering i prostatektomiprøver er forskjellig mellom menn med en diett med høyt og lavt innhold av henholdsvis fytoøstrogener, eller mellom ulike genotyper av ERβ-genet.

Studieprotokoll: Gjennom behandlende leger vil etterforskerne identifisere 240 menn i Västra Götaland helsevesen som har blitt diagnostisert med prostatakreft med middels risikonivå (T1-T2, Gleason score

Intervensjon: Pasienter vil bli introdusert for intervensjonsdietten av en ernæringsfysiolog og vil få generell informasjon om sunne matvalg (i henhold til anbefalinger for allmennheten) og ikke spise noen kosttilskudd, ingen andre kostholdsrestriksjoner vil bli gitt. Pasientene vil få en pakke som inneholder mat med høy mengde fytoøstrogener (≥100 mg isoflavonoider og ≥100 mg lignaner) som skal inntas daglig. Intervensjonen fortsetter til dagen før operasjonen (minst 6 uker). Pasientene i kontrollgruppen vil bli informert på samme måte som intervensjonsgruppen bortsett fra at de ikke vil motta matpakke.

Endepunkt: Effekten av dietten på tumorproliferasjonsraten vil bli målt ved å gjøre sammenligninger av 1) prosentandel av positive celler som inneholder markøren Ki-67, 2) PSA-nivåer, 3) ekspresjon av gener involvert i proliferasjon og ER-signalveier og celle-syklusprogresjon (CCP) genuttrykk. I umiddelbar nærhet til operasjonen, samler kirurgen inn fire median-nålsbiopsier fra den ferske prostataprøven, to fra tumorstedet og to fra sunt prostatavev, basert på tidligere resultater fra diagnostiske biopsier og magnetisk resonansavbildning. Også ved operasjonen. , blir det radikale prostatektomivevet samlet og formalinfiksert parafin innstøpt. Blodprøver vil bli tatt i begynnelsen av studien, dagen før operasjonen, og sendes til analyse av PSA (gratis og total). De absolutte forskjellene i PSA-nivåer og PSA-doblingstiden vil bli beregnet. I tillegg vil etterforskerne måle uttrykket av AR, ERα og ERß i tumorvev og blodnivået av hormoner, testosteron, DHT, østradiol og 3ß-Adiol.

Spørreskjema: Alle pasienter vil svare på et passordbeskyttet spørreskjema ved baseline, operasjon, vekt og høyde vil bli målt. En gang i løpet av 6-ukersperioden vil det bli utført et 24-timers tilbakekallingsintervju, der deltakernes matinntak i løpet av de foregående 24 timene vil bli registrert. Det individuelle inntaket av energi og spesifikke næringsstoffer vil bli estimert ved å koble informasjon fra spørreskjema og kostholdsjournal til Mattilsynets ernæringsdatabase og vår tidligere utviklede fytoøstrogendatabase. Informasjon om mulig bruk av Finasteride, en 5α-reduktasehemmer, vil bli samlet inn fra medisinske journaler.

Analyse av polymorfer:SNP i ERß-genet vil bli analysert i blodprøver, ved bruk av den PCR-baserte metoden kompetitiv allelspesifikk PCR (KASP™). Allel-konstitusjonen vil bli identifisert og deltakerne vil bli tildelt gruppe TT, TC eller CC. Analyse av Ki-67: Biopsiprøven fikseres ved nedsenking med 4 % paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer i 24 timer ved +4°C. Deretter dehydreres det med gradert etanol etterfulgt av xylen og parafininnstøping. Parafinseksjoner varmes opp i 30 minutter ved 60ºC, forhåndsbehandlet med sitronsyrebuffer. Uspesifikk binding blokkeres av eselserum i fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder Triton X-100 i 30 minutter. Inkubering med Ki-67-antistoff over natten (4ºC) etterfulgt av inkubering med passende sekundært biotinylert antistoff. For å forsterke signalet behandles snittene med avidin-biotin-kompleksløsning, og for å visualisere immunreaktiviteten brukes Diaminobenzidin (DAB). Fargede tumorceller (Ki-67 positivitet) vil bli talt og resultatet vil bli rapportert som forholdet mellom positive kjerner delt på det totale antallet evaluert × 100.

Analyse av reseptor-uttrykk, CCP-score, hormonnivåer og PSA: Vevsprøver tatt ved operasjon legges i RNA-senere før de fryses. Prøvene vil bli analysert med RNeasy plus Universal Mini Kits (QIAGEN), og sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR). ERα, ERβ og AR mRNA-ekspresjon vil bli bestemt ved bruk av TaqMan-analyse. Totalt RNA vil bli ekstrahert fra formalinfikserte parafininnstøpte seksjoner av svulster og godartet vev ved å bruke den globale transkriptomomfattende ekspresjonsarrayen Clariom™ D (Thermos Fischer). For analyse av CCP-skåren, genuttrykk av genene involvert i CCP basert på henholdsvis Prolaris®-genpanelet og Decipher Score. PSA-blodnivåer vil bli analysert i henhold til standard klinisk protokoll.

Kraftberegning: I helseregionen Västra Götaland i 2012 hadde 321 menn prostatakreft med middels risiko som de fikk kurativ behandling for. Beregning med primærutfall (Ki-67) gir for en studiegruppe bestående av 118 pasienter 80 % effekt for en tosidig test med signifikansnivå på 0,05 og effektstørrelse på 0,5. Forskerne fant i tidligere studier at omtrent 42 % av den mannlige populasjonen er heterozygot eller homozygot for variantallelen (TC/CC) av ERβ-promoterregionen SNP (rs2987983-13950 T/C) og 58 % homozygote for villtypeallelen (TT). Siden etterforskerne forventer at effekten av intervensjonen er større blant forsøkspersoner med variantallelen, mens mindre blant forsøkspersoner med villtypeallelen, bør denne sistnevnte gruppen være stor nok til å kunne finne en forskjell hvis en finnes. Det er derfor behov for en total prøvestørrelse på 118/58 %=203 pasienter.

Statistiske betraktninger: Etterforskerne vil bruke intensjon-å-behandle-metoden. I design og datainnsamling er det gjort testing av legemidler som mal (randomisering, placebo, blinding, ingen slitasje, ingen differensielle målefeil, korrekt analyse); for avvikene fra den perfekte situasjonen bruker etterforskerne epidemiologisk teori for å veilede analysene og tolke resultatene. Foreløpige analyser, basert på gjennomsnitt, medianer, standardavvik og interkvantilt område vil bli gitt for å beskrive resultatene av interesse, og stratifisering vil bli utført for å vurdere ytelsen til randomiseringen av den tildelte dietten. Boksplott vil derfor bli produsert for å grafisk vurdere de tidsmessige trendene i responsen. Fordelingen av resultatene vil bli studert og passende transformasjoner vil bli brukt, om nødvendig, for å forbedre symmetri og normalitet. På grunn av den langsgående strukturen til dataene, vil korrelasjon mellom observasjoner bli inkorporert og lineære blandede effektmodeller vil bli utført for å studere om (i) det er en tidsmessig trend (ii) hvis den lineære trenden er forskjellig mellom behandlede og ubehandlede individer (iii) ) hvis behandlingseffekten mellom intervensjonsgruppen og kontrollgruppen modifiseres i henhold til ERß-genotyper, både for vanlig og variant. Et nøkkeltrinn i analyse av longitudinelle data er å identifisere den passende kovariansstrukturen som beskriver korrelasjonene mellom datapunktene: uavhengig kovarians (ingen korrelasjon), utskiftbar kovarians (lik korrelasjon) eller autoregressiv kovarians med korrelasjon mellom responser som avtar med tiden mellom målinger. Etterforskerne vil identifisere den mest hensiktsmessige strukturen, verifisert empirisk ved hjelp av en informasjonsteoretisk tilnærming. Både statistiske tester og konfidensintervaller vil bli produsert for å vurdere betydningen av effektene, partielle F-testprosedyrer vil derfor bli brukt for å studere den samlede effekten av hoved- og interaksjonsvariabler og hensiktsmessige statistiske metoder vil bli brukt for å studere modelltilpasning. Sammenhengen mellom inntak av fytoøstrogener og kreftproliferasjon vil bli evaluert av generaliserte lineære modeller, som vil gi estimater av risikoforskjellen (RDs) og tilsvarende 95 % CI, stratifisert etter ERβ-genotyper. Interaksjoner mellom fytoøstrogeninntak og ERβ SNPs på spredning vil bli evaluert med tanke på additive effektskalaer. Gruppe av fytoøstrogeninntak er inkludert som en kontinuerlig variabel, og hver SNP er representert med en indikatorvariabel (variant eller ikke). Interaksjon vil bli vurdert i en lineær oddsmodell ved produkttermen mellom kovariatene som representerer fytoøstrogeninntak og SNP-genotyper.