Können Phytoöstrogene aus der Nahrung die Proliferation von Prostatatumoren verlangsamen? (PRODICA)

Daten aus ökologischen und experimentellen Studien zeigen eindeutig eine protektive Wirkung von Phytoöstrogenen aus der Nahrung gegen Prostatakrebs. Genetische Faktoren sind auch bei Prostatakrebs von ätiologischer Bedeutung, und es gibt zunehmend Hinweise auf die Bedeutung einer Gen-Ernährungs-Interaktion bei der Progression von Prostatakrebs. Die Forscher haben kürzlich eine mutmaßliche genetische Wechselwirkung für diese Schutzfunktion von Phytoöstrogenen gefunden. Das insgesamt verringerte Risiko für Prostatakrebs bei Männern mit einer hohen Aufnahme von Phytoöstrogenen wurde durch eine Nukleotidsequenzvariante im Östrogenrezeptor-beta (ERß)-Gen stark modifiziert. Eine amerikanische Studie fand einen ähnlichen Wechselwirkungseffekt zwischen der Einnahme von Phytoöstrogenen, sowie dem Body-Mass-Index (BMI), und einer weiteren Nukleotidsequenz-Variante im ERß. Die Phytoöstrogene Isoflavonoide und Coumestane binden fest an den Östrogenrezeptor-beta (ERß) und werden hauptsächlich gefunden in Soja und anderen Bohnen. Es wurde festgestellt, dass die ERß-Expression am Fortschreiten von Prostatakrebs beteiligt ist, was darauf hindeutet, dass Phytoöstrogene mit ERß bei der Entwicklung von Prostatakrebs interagieren können. Im Hinblick auf potenzielle krebserzeugende Mechanismen können Phytoöstrogene an der endokrinen Kontrolle des Prostatazellwachstums beteiligt sein, indem sie das Gleichgewicht zwischen AR und ERß beeinflussen. Im Gegensatz dazu unterdrückt 5α Androstan-3ß,17ß-diol (3ßAdiol), ein Metabolit von DHT, durch die Bindung an ERß die Expression von AR und hemmt dadurch die androgengesteuerte Proliferation, während es die Zelldifferenzierung fördert. In Bezug auf die Proliferation deuten aktuelle Daten auf eine kombinierte stimulierende Rolle von ERα und AR in der Prostata hin, während ERß die Proliferation hemmt und die Differenzierung stimuliert. Sowohl Östrogen ERα als auch ß haben eine Affinität zu Östradiol, während Phytoöstrogene und 3ßAdiol selektiv ERß aktivieren. Phytoöstrogene sollten demzufolge in der Lage sein, das Krebswachstum einzuschränken, indem sie als Ersatz für 3ßAdiol wirken. Dies wird durch experimentelle Studien bestätigt.

Ergebnisse aus früheren Interventionsstudien haben vielversprechende Ergebnisse geliefert, die darauf hindeuten, dass bestimmte Ernährungs- oder Lebensstiländerungen das Fortschreiten von Prostatakrebs beeinflussen können, obwohl die meisten dieser Studien von relativ kurzer Dauer waren und auf einer relativ kleinen Anzahl von Patienten basierten. Beispielsweise zeigte eine randomisierte Studie, dass Männer, denen Leinsamen als Nahrungsergänzung verabreicht wurden, einen geringeren Prozentsatz positiver Zellen mit dem Proliferationsmarker Ki-67 aufwiesen als Männer, die diesen Zusatz zu ihrer Ernährung nicht erhalten hatten. Zusammengenommen weisen die vorliegenden Beweise auf die Möglichkeit für Prostatakrebspatienten hin, mit lebensstilbezogenen Behandlungsalternativen zu ergänzen, um das Fortschreiten des Tumors zu verhindern oder zu verzögern.

Spezifisches Ziel: Durchführung einer kontrollierten, randomisierten Ernährungsinterventionsstudie bei Männern mit Prostatakrebs. Die Untersucher verfolgen dabei folgende konkrete Ziele/Hypothese:

1. „Bei Männern mit Prostatakrebs mit mittlerem Risiko wird eine phytoöstrogenreiche Ernährung das Fortschreiten des Tumors im Vergleich zu Männern mit einer phytoöstrogenarmen Ernährung reduzieren.“
2. "Die Auswirkungen einer phytoöstrogenreichen Ernährung auf die Tumorprogression bei Prostatakrebs unterscheiden sich zwischen Männern mit unterschiedlichen Genotypen von Polymorphismen im ERß-Gen". Die Männer werden in zwei Untergruppen, diejenigen mit TT- oder TC/CC-Allelen, des Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) rs2987983-13950 T/C im ERß-Gen eingeteilt, in denen die Hypothese getestet wird.
3. Um zu bestimmen, ob sich die RNA-Expression von AR, ERα und ERβ in Prostatatumorgewebe sowie die Spiegel von Steroidhormonen zwischen Männern mit einer Ernährung mit hohem bzw. niedrigem Phytoöstrogengehalt oder zwischen verschiedenen Genotypen des ERβ-Gens unterscheiden.
4. Um zu bestimmen, ob sich die mRNA-Expression von Genen, die an der Proliferation beteiligt sind, und ER-Signalwegen, die durch vollständiges Transkriptom-Profiling in Prostatektomieproben analysiert wurden, zwischen Männern mit einer Ernährung mit hohem bzw. niedrigem Phytoöstrogengehalt oder zwischen verschiedenen Genotypen des ERβ-Gens unterscheidet.

Studienprotokoll: Durch behandelnde Ärzte werden die Ermittler 240 Männer in der Gesundheitsregion Västra Götaland identifizieren, bei denen Prostatakrebs mit mittlerem Risiko (T1-T2, Gleason-Score) diagnostiziert wurde

Intervention: Die Patienten werden von einem Ernährungsberater in die Interventionsdiät eingeführt und erhalten allgemeine Informationen zur gesunden Ernährung (gemäß Empfehlungen für die breite Öffentlichkeit) und zum Verzicht auf Nahrungsergänzungsmittel, es werden keine anderen diätetischen Einschränkungen gegeben. Die Patienten erhalten ein Paket mit Lebensmitteln mit einem hohen Gehalt an Phytoöstrogenen (≥ 100 mg Isoflavonoide und ≥ 100 mg Lignane), die täglich verzehrt werden sollen. Der Eingriff dauert bis zum Tag vor der Operation (mindestens 6 Wochen). Die Patienten der Kontrollgruppe werden wie die Interventionsgruppe informiert, außer dass sie kein Lebensmittelpaket erhalten.

Endpunkt: Die Auswirkung der Diät auf die Tumorproliferationsrate wird gemessen, indem Vergleiche durchgeführt werden von 1) dem Prozentsatz positiver Zellen, die den Marker Ki-67 enthalten, 2) PSA-Spiegeln, 3) der Expression von Genen, die an der Proliferation und den ER-Signalwegen beteiligt sind, und Genexpression der Zellzyklusprogression (CCP). Unmittelbar neben der Operation entnimmt der Chirurg vier Median-Nadel-Biopsien aus dem frischen Prostatapräparat, zwei aus der Tumorstelle und zwei aus gesundem Prostatagewebe, basierend auf früheren Ergebnissen aus den diagnostischen Biopsien und der Magnetresonanztomographie. Ebenfalls in der Operation werden die radikalen Prostatektomie-Gewebe gesammelt und formalinfixiertes Paraffin eingebettet. Zu Beginn der Studie, am Tag vor der Operation, werden Blutproben entnommen und zur PSA-Analyse (frei und gesamt) geschickt. Die absoluten Differenzen der PSA-Werte und die PSA-Verdopplungszeit werden berechnet. Außerdem werden die Forscher die Expression von AR, ERα und ERß im Tumorgewebe und die Blutspiegel von Hormonen, Testosteron, DHT, Estradiol und 3ß-Adiol messen.

Fragebogen: Alle Patienten werden zu Studienbeginn einen passwortgeschützten Fragebogen beantworten, Operation, Gewicht und Größe werden gemessen. Einmal innerhalb der 6 Wochen wird ein 24-h-Recall-Interview durchgeführt, bei dem die Nahrungsaufnahme der Teilnehmer in den vorangegangenen 24 h registriert wird. Die individuelle Aufnahme von Energie und spezifischen Nährstoffen wird abgeschätzt, indem Informationen aus dem Fragebogen und dem Ernährungsprotokoll mit der Ernährungsdatenbank der National Food Agency und unserer zuvor entwickelten Phytoöstrogen-Datenbank verknüpft werden. Informationen über die mögliche Anwendung von Finasterid, einem 5α-Reduktase-Hemmer, werden aus Krankenakten gesammelt.

Analyse von Polymorphen: SNP im ERß-Gen werden in Blutproben analysiert, wobei die PCR-basierte Methode Competitive Allele Specific PCR (KASP™) verwendet wird. Die Allelkonstitution wird identifiziert und die Teilnehmer werden der Gruppe TT, TC oder CC zugeordnet. Analyse von Ki-67: Die Biopsieprobe wird durch Eintauchen mit 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer während 24 Stunden bei +4°C fixiert. Dann wird es mit abgestuftem Ethanol dehydriert, gefolgt von Xylol und Einbettung in Paraffin. Paraffinschnitte werden 30 Minuten lang auf 60 °C erhitzt und mit Zitronensäurepuffer vorbehandelt. Die unspezifische Bindung wird durch Eselserum in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die Triton X-100 enthält, für 30 Minuten blockiert. Inkubation mit Ki-67-Antikörper über Nacht (4 °C), gefolgt von Inkubation mit dem geeigneten sekundären biotinylierten Antikörper. Zur Verstärkung des Signals werden die Schnitte mit Avidin-Biotin-Komplex-Lösung behandelt und zur Visualisierung der Immunreaktivität wird Diaminobenzidin (DAB) verwendet. Angefärbte Tumorzellen (Ki-67-Positivität) werden gezählt und das Ergebnis als Verhältnis der positiven Zellkerne dividiert durch die bewertete Gesamtzahl × 100 angegeben.

Analyse von Rezeptor-Expression, CCP-Score, Hormonspiegel und PSA: Gewebeproben, die bei der Operation entnommen werden, werden später in RNA eingebracht und eingefroren. Die Proben werden mit RNeasy plus Universal Mini Kits (QIAGEN) und Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) analysiert. Die ERα-, ERβ- und AR-mRNA-Expression wird unter Verwendung des TaqMan-Assays bestimmt. Gesamt-RNA wird aus Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Schnitten von Tumoren und gutartigen Geweben unter Verwendung des globalen Transkriptom-weiten Expressionsarrays Clariom™ D (Thermos Fischer) extrahiert. Zur Analyse des CCP-Scores wird die Genexpression der an CCP beteiligten Gene auf der Grundlage des Prolaris®-Genpanels bzw. des Decipher-Scores ermittelt. Die PSA-Blutwerte werden gemäß dem klinischen Standardprotokoll analysiert.

Power-Berechnung: In der Gesundheitsregion Västra Götaland litten 2012 321 Männer an Prostatakrebs mit mittlerem Risiko, für den sie eine kurative Behandlung erhielten. Die Berechnung mit dem primären Endpunkt (Ki-67) ergibt für eine Studiengruppe bestehend aus 118 Patienten eine 80 % Power für einen zweiseitigen Test mit einem Signifikanzniveau von 0,05 und einer Effektgröße von 0,5. Die Forscher fanden in früheren Studien heraus, dass etwa 42 % der männlichen Bevölkerung heterozygot oder homozygot für das Varianten-Allel (TC/CC) der ERβ-Promotorregion SNP (rs2987983-13950 T/C) und 58 % homozygot für das Wildtyp-Allel sind (TT). Da die Forscher erwarten, dass die Wirkung der Intervention bei Probanden mit dem Varianten-Allel größer ist, während sie bei Probanden mit dem Wildtyp-Allel kleiner ist, sollte diese letztere Gruppe groß genug sein, um einen Unterschied feststellen zu können, falls einer vorhanden ist. Somit wird eine Gesamtstichprobengröße von 118/58 % = 203 Patienten benötigt.

Statistische Erwägungen: Die Ermittler wenden die Intention-to-treat-Methode an. Beim Design und der Datenerhebung wurden Tests von Arzneimitteln als Vorlage vorgenommen (Randomisierung, Placebo, Verblindung, keine Attrition, keine differenziellen Messfehler, korrekte Analyse); Für die Abweichungen von der perfekten Situation verwenden die Ermittler die epidemiologische Theorie, um die Analysen zu leiten und die Ergebnisse zu interpretieren. Vorläufige Analysen auf der Grundlage von Mittelwerten, Medianen, Standardabweichungen und Interquantilbereichen werden bereitgestellt, um die interessierenden Ergebnisse richtig zu beschreiben, und es wird eine Stratifizierung durchgeführt, um die Leistung der Randomisierung der zugewiesenen Ernährung zu bewerten. Daher werden Boxplots erstellt, um die zeitlichen Trends in der Antwort grafisch auszuwerten. Die Verteilung der Ergebnisse wird untersucht und bei Bedarf werden geeignete Transformationen angewendet, um Symmetrie und Normalität zu verbessern. Aufgrund der Längsstruktur der Daten werden Korrelationen zwischen Beobachtungen einbezogen und lineare Mixed-Effects-Modelle durchgeführt, um zu untersuchen, ob (i) es einen zeitlichen Trend gibt (ii) ob sich der lineare Trend zwischen behandelten und unbehandelten Personen unterscheidet (iii ), wenn der Behandlungseffekt zwischen der Interventionsgruppe und der Kontrollgruppe gemäß den ERß-Genotypen modifiziert wird, sowohl für die gemeinsame als auch für die Variante. Ein wichtiger Schritt bei der Analyse von Längsschnittdaten besteht darin, die geeignete Kovarianzstruktur zu identifizieren, die die Korrelationen zwischen den Datenpunkten beschreibt: unabhängige Kovarianz (keine Korrelation), austauschbare Kovarianz (gleiche Korrelation) oder autoregressive Kovarianz, wobei die Korrelation zwischen den Antworten mit der Zeit zwischen den Messungen abnimmt. Die Ermittler identifizieren die am besten geeignete Struktur, empirisch verifiziert mit Hilfe eines informationstheoretischen Ansatzes. Zur Beurteilung der Signifikanz der Effekte werden sowohl statistische Tests als auch Konfidenzintervalle erstellt, zur Untersuchung der kombinierten Wirkung von Haupt- und Interaktionsvariablen werden daher partielle F-Testverfahren eingesetzt und zur Untersuchung der Modellanpassung werden geeignete statistische Methoden angewendet. Der Zusammenhang zwischen der Aufnahme von Phytoöstrogenen und der Krebsproliferation wird durch verallgemeinerte lineare Modelle bewertet, die Schätzungen der Risikodifferenz (RDs) und der entsprechenden 95% CIs liefern, stratifiziert nach ERβ-Genotypen. Wechselwirkungen zwischen Phytoöstrogenaufnahme und ERβ-SNPs auf die Proliferation werden unter Berücksichtigung additiver Effektskalen bewertet. Die Gruppe der Phytoöstrogenaufnahme wird als kontinuierliche Variable aufgenommen, und jeder SNP wird durch eine Indikatorvariable (Variante oder nicht) dargestellt. Die Wechselwirkung wird in einem linearen Wahrscheinlichkeitsmodell anhand des Produktterms zwischen den Kovariaten, die die Phytoöstrogenaufnahme und die SNP-Genotypen darstellen, bewertet.