Czy dietetyczne fitoestrogeny mogą spowolnić proliferację guza prostaty? (PRODICA)

Dane z badań ekologicznych i eksperymentalnych wyraźnie wskazują na ochronny wpływ dietetycznych fitoestrogenów na raka prostaty. Czynniki genetyczne mają również znaczenie etiologiczne w raku prostaty i istnieje coraz więcej dowodów na znaczenie interakcji gen-dieta w progresji raka prostaty. Badacze odkryli niedawno przypuszczalną interakcję genetyczną dla tej ochronnej roli fitoestrogenów. Ogólne zmniejszone ryzyko raka prostaty u mężczyzn spożywających duże ilości fitoestrogenów zostało silnie zmodyfikowane przez wariant sekwencji nukleotydów w genie receptora estrogenowego beta (ERß). Amerykańskie badanie wykazało podobny interakcyjny efekt między przyjmowaniem fitoestrogenów, a także wskaźnikiem masy ciała (BMI) i innym wariantem sekwencji nukleotydów w ERß. Fitoestrogeny, izoflawonoidy i kumestany, wiążą się ściśle z receptorem beta estrogenu (ERß) i są głównie w soi i innych ziarnach. Stwierdzono, że ekspresja ERß bierze udział w progresji raka prostaty, co sugeruje, że fitoestrogeny mogą wchodzić w interakcje z ERß w rozwoju raka prostaty. Ze względu na potencjalne mechanizmy rakotwórcze, fitoestrogeny mogą brać udział w regulacji hormonalnej wzrostu komórek prostaty poprzez wpływ na równowagę pomiędzy AR a ERß. Testosteron i jego metabolit 5α-dihydrotestosteron (DHT) powodują proliferację komórek nabłonka prostaty poprzez wiązanie się z AR. W przeciwieństwie do tego, wiążąc się z ERß, 5α androstan-3ß,17ß-diol (3ßAdiol), metabolit DHT, hamuje ekspresję AR, a tym samym hamuje proliferację sterowaną przez androgeny, jednocześnie promując różnicowanie komórek. Jeśli chodzi o proliferację, obecne dane sugerują łączną stymulującą rolę ERα i AR w prostacie, podczas gdy ERß hamuje proliferację i stymuluje różnicowanie. Zarówno estrogeny ERα, jak i ß mają powinowactwo do estradiolu, podczas gdy fitoestrogeny i 3ßAdiol selektywnie aktywują ERß. Fitoestrogeny powinny w rezultacie być w stanie ograniczyć wzrost raka, działając jako substytut 3ßAdiolu. Potwierdzają to badania eksperymentalne.

Wyniki poprzednich badań interwencyjnych dały obiecujące wyniki wskazujące, że pewne modyfikacje diety lub stylu życia mogą wpływać na progresję raka prostaty, chociaż większość z tych badań była dość krótka i opierała się na stosunkowo niewielkiej liczbie pacjentów. Na przykład randomizowane badanie wykazało, że mężczyźni, którym podawano dodatek siemienia lnianego w diecie, mieli niższy odsetek pozytywnych komórek zawierających marker proliferacji Ki-67 niż mężczyźni, którzy nie otrzymywali tego dodatku do swojej diety. Podsumowując, obecne dowody wskazują na możliwość uzupełnienia leczenia przez pacjentów z rakiem prostaty o alternatywne metody leczenia związane ze stylem życia w celu zapobieżenia lub opóźnienia progresji nowotworu.

Cel szczegółowy: Przeprowadzenie kontrolowanego, randomizowanego badania dotyczącego interwencji dietetycznej u mężczyzn z rakiem prostaty. Badacze będą dążyć do następujących konkretnych celów/hipotez:

1. „Wśród mężczyzn z rakiem prostaty o średnim poziomie ryzyka dieta bogata w fitoestrogeny zmniejszy progresję nowotworu w porównaniu z mężczyznami o diecie ubogiej w fitoestrogeny”.
2. „Wpływ diety bogatej w fitoestrogeny na progresję raka prostaty różni się u mężczyzn z różnymi genotypami polimorfizmów w genie ERß”. Mężczyźni zostaną podzieleni na dwie podgrupy, posiadające allele TT lub TC/CC polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) rs2987983-13950 T/C w genie ERß, w których hipoteza zostanie przetestowana.
3. Określenie, czy ekspresja RNA AR, ERα i ERβ w tkance guza prostaty, jak również poziomy hormonów steroidowych, różnią się między mężczyznami o diecie odpowiednio bogatej i ubogiej w fitoestrogeny lub między różnymi genotypami genu ERβ.
4. Aby określić, czy ekspresja mRNA genów zaangażowanych w proliferację i szlaki sygnałowe ER analizowane przez całe profilowanie transkryptomiczne w próbkach prostatektomii różni się między mężczyznami z dietą odpowiednio bogatą i niską w fitoestrogeny lub między różnymi genotypami genu ERβ.

Protokół badania: Za pośrednictwem lekarzy prowadzących badacze zidentyfikują 240 mężczyzn z regionu opieki zdrowotnej Västra Götaland, u których zdiagnozowano raka prostaty o średnim poziomie ryzyka (T1-T2, w skali Gleasona

Interwencja: Pacjenci zostaną wprowadzeni przez dietetyka do diety interwencyjnej i otrzymają ogólne informacje dotyczące zdrowego odżywiania (zgodnie z zaleceniami dla ogółu społeczeństwa) oraz niespożywania żadnych suplementów diety, nie zostaną podane żadne inne ograniczenia dietetyczne. Pacjentki otrzymają paczkę zawierającą pokarm z dużą zawartością fitoestrogenów (≥100 mg izoflawonoidów i ≥100 mg lignanów), które mają być spożywane codziennie. Interwencja trwa do dnia poprzedzającego operację (co najmniej 6 tygodni). Pacjenci z grupy kontrolnej zostaną poinformowani w taki sam sposób jak grupa interwencyjna, z wyjątkiem tego, że nie otrzymają żadnej paczki żywnościowej.

Punkt końcowy: Wpływ diety na szybkość proliferacji nowotworu będzie mierzony poprzez porównanie 1) odsetka komórek dodatnich zawierających marker Ki-67, 2) poziomów PSA, 3) ekspresji genów zaangażowanych w proliferację i szlaki sygnałowe ER oraz ekspresja genu progresji cyklu komórkowego (CCP). W bezpośrednim sąsiedztwie operacji chirurg pobiera cztery biopsje gruboigłowe ze świeżego wycinka prostaty, dwie z miejsca guza i dwie ze zdrowej tkanki stercza, na podstawie wcześniejszych wyników biopsji diagnostycznych i rezonansu magnetycznego. Również w gabinecie , tkanki po radykalnej prostatektomii są pobierane i zatapiane w parafinie utrwalonej w formalinie. Próbki krwi zostaną pobrane na początku badania, w dniu poprzedzającym operację i przesłane do analizy PSA (wolnego i całkowitego). Zostaną obliczone bezwzględne różnice poziomów PSA i czas podwojenia PSA. Ponadto badacze zmierzą ekspresję AR, ERα i ERß w tkance nowotworowej oraz poziom hormonów, testosteronu, DHT, estradiolu i 3ß-Adiolu we krwi.

Kwestionariusz: wszyscy pacjenci odpowiedzą na kwestionariusz chroniony hasłem na początku badania, zostanie zmierzony zabieg chirurgiczny, waga i wzrost. Raz w okresie 6 tygodni zostanie przeprowadzony 24-godzinny wywiad przypominający, w którym rejestrowane będzie spożycie pokarmu przez uczestników w ciągu poprzedzających 24 godzin. Indywidualne spożycie energii i określonych składników odżywczych zostanie oszacowane poprzez powiązanie informacji z kwestionariusza i zapisu diety z bazą danych żywieniowych Narodowej Agencji Żywności i naszą wcześniej opracowaną bazą danych fitoestrogenów. Informacje o możliwości zastosowania Finasterydu, inhibitora 5α-reduktazy, będą zbierane z dokumentacji medycznej.

Analiza polimorfów:SNP w genie ERß zostanie przeanalizowana w próbkach krwi przy użyciu metody PCR opartej na kompetycyjnym allelu specyficznym PCR (KASP™). Konstytucja allelu zostanie zidentyfikowana, a uczestnicy zostaną przydzieleni do grupy TT, TC lub CC. Analiza Ki-67: Próbkę biopsyjną utrwala się przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M buforze fosforanowym na 24 godziny w temperaturze +4°C. Następnie jest odwadniany stopniowanym etanolem, a następnie zatapiany w ksylenie i parafinie. Skrawki parafinowe ogrzewa się przez 30 minut w temperaturze 60ºC, wstępnie traktuje buforem z kwasem cytrynowym. Niespecyficzne wiązanie jest blokowane przez ośle surowicę w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej Triton X-100 przez 30 minut. Inkubacja z przeciwciałem Ki-67 przez noc (4ºC), a następnie inkubacja z odpowiednim drugorzędowym biotynylowanym przeciwciałem. W celu wzmocnienia sygnału skrawki traktuje się roztworem kompleksu awidyna-biotyna, aw celu wizualizacji immunoreaktywności stosuje się diaminobenzydynę (DAB). Wybarwione komórki nowotworowe (pozytywność wobec Ki-67) zostaną zliczone, a wynik podany jako stosunek jąder dodatnich podzielony przez całkowitą liczbę ocenionych × 100.

Analiza ekspresji receptora, punktacji CCP, poziomów hormonów i PSA: Próbki tkanek pobrane podczas zabiegu umieszcza się później w RNA przed zamrożeniem. Próbki zostaną przeanalizowane przy użyciu zestawów RNeasy plus Universal Mini Kits (QIAGEN) i reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR). Ekspresja mRNA ERα, ERβ i AR zostanie określona za pomocą testu TaqMan. Całkowity RNA zostanie wyekstrahowany z utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków guzów i łagodnych tkanek przy użyciu globalnej macierzy ekspresyjnej obejmującej cały transkryptom Clariom™ D (Thermos Fischer). W celu analizy wyniku CCP, ekspresja genów zaangażowanych w CCP, odpowiednio na podstawie panelu genów Prolaris® i wyniku Decipher. Poziomy PSA we krwi będą analizowane zgodnie ze standardowym protokołem klinicznym.

Obliczanie mocy: w regionie opieki zdrowotnej Västra Götaland w 2012 r. 321 mężczyzn miało raka prostaty o średnim stopniu ryzyka, z powodu którego otrzymali leczenie. Obliczenia z wykorzystaniem wyniku pierwotnego (Ki-67) dają grupie badawczej składającej się ze 118 pacjentów moc 80% dla testu dwustronnego z poziomem istotności 0,05 i wielkością efektu 0,5. Badacze stwierdzili we wcześniejszych badaniach, że około 42% męskiej populacji to heterozygoty lub homozygoty pod względem wariantu allelu (TC/CC) regionu promotora ERβ SNP (rs2987983-13950 T/C), a 58% to homozygoty pod względem allelu typu dzikiego (TT). Ponieważ badacze spodziewają się, że efekt interwencji będzie większy wśród osób z wariantem allelu, a mniejszy wśród osób z allelem typu dzikiego, ta ostatnia grupa powinna być wystarczająco duża, aby móc znaleźć różnicę, jeśli taka istnieje. Dlatego potrzebna jest całkowita wielkość próby 118/58% = 203 pacjentów.

Względy statystyczne: Badacze zastosują metodę zamiaru leczenia. W projekcie i zbieraniu danych wykonano badania leków jako szablon (randomizacja, placebo, zaślepienie, brak ścierania, brak różnicowych błędów pomiarowych, poprawna analiza); w przypadku odchyleń od idealnej sytuacji badacze wykorzystują teorię epidemiologiczną do prowadzenia analiz i interpretacji wyników. Wstępne analizy, oparte na średnich, medianach, odchyleniach standardowych i rozstępach międzykwantylowych, zostaną dostarczone w celu właściwego opisania wyników będących przedmiotem zainteresowania, a stratyfikacja zostanie przeprowadzona w celu oceny wyników randomizacji przypisanej diety. Zostaną zatem utworzone wykresy skrzynkowe w celu graficznej oceny czasowych trendów odpowiedzi. Rozkład wyników zostanie zbadany iw razie potrzeby zastosowane zostaną odpowiednie transformacje w celu poprawy symetrii i normalności. Ze względu na podłużną strukturę danych uwzględniona zostanie korelacja między obserwacjami i przeprowadzone zostaną liniowe modele efektów mieszanych w celu zbadania, czy (i) istnieje trend czasowy (ii) czy trend liniowy różni się między osobami leczonymi i nieleczonymi (iii ) jeśli efekt leczenia między grupą interwencyjną a grupą kontrolną jest modyfikowany zgodnie z genotypami ERß, zarówno dla odmiany pospolitej, jak i wariantu. Kluczowym krokiem w analizie danych podłużnych jest określenie odpowiedniej struktury kowariancji opisującej korelacje między punktami danych: kowariancji niezależnej (brak korelacji), kowariancji wymiennej (korelacja równa) lub kowariancji autoregresyjnej, w której korelacja między odpowiedziami maleje wraz z upływem czasu między pomiarami. Badacze zidentyfikują najbardziej odpowiednią strukturę, zweryfikowaną empirycznie za pomocą teoretycznego podejścia informacyjnego. W celu oceny istotności efektów zostaną opracowane zarówno testy statystyczne, jak i przedziały ufności, w związku z czym procedury częściowego testu F zostaną wykorzystane do zbadania połączonego efektu głównych i interakcji zmiennych, a odpowiednie metody statystyczne zostaną zastosowane do badania dopasowania modelu. Związek między spożyciem fitoestrogenów a proliferacją raka zostanie oceniony za pomocą uogólnionych modeli liniowych, które dostarczą szacunków różnicy ryzyka (RD) i odpowiadających im 95% przedziałów ufności, podzielonych według genotypów ERβ. Interakcje między przyjmowaniem fitoestrogenów a SNP ERβ na proliferację zostaną ocenione z uwzględnieniem skal efektów addytywnych. Grupa spożycia fitoestrogenów jest uwzględniona jako zmienna ciągła, a każdy SNP jest reprezentowany przez zmienną wskaźnikową (wariant lub nie). Interakcja zostanie oceniona w liniowym modelu szans na podstawie iloczynu między zmiennymi towarzyszącymi reprezentującymi spożycie fitoestrogenu i genotypy SNP.