Os fitoestrógenos dietéticos podem retardar a proliferação do tumor da próstata? (PRODICA)

Dados de estudos ecológicos e experimentais mostram claramente um efeito protetor dos fitoestrógenos dietéticos contra o câncer de próstata. Fatores genéticos também são de importância etiológica no câncer de próstata e há evidências crescentes da importância de uma interação gene-dieta na progressão do câncer de próstata. Os pesquisadores descobriram recentemente uma suposta interação genética para esse papel protetor dos fitoestrógenos. O risco geral diminuído de câncer de próstata em homens com alta ingestão de fitoestrogênios foi fortemente modificado por uma variante da sequência de nucleotídeos no gene do receptor beta de estrogênio (ERß). Um estudo americano encontrou um efeito interativo semelhante entre a ingestão de fitoestrógenos, bem como o índice de massa corporal (IMC) e outra variante da sequência de nucleotídeos no ERß. encontrado na soja e em outros feijões. Verificou-se que a expressão de ERß está envolvida na progressão do câncer de próstata, sugerindo que os fitoestrógenos podem interagir com ERß no desenvolvimento do câncer de próstata. Com relação aos potenciais mecanismos carcinogênicos, os fitoestrógenos podem estar envolvidos no controle endócrino do crescimento das células da próstata, influenciando o equilíbrio entre AR e ERß. Em contraste, ao se ligar ao ERß, o 5α androstano-3ß,17ß-diol (3ßAdiol), um metabólito do DHT, reprime a expressão do AR e, assim, inibe a proliferação induzida por andrógenos enquanto promove a diferenciação celular. Em termos de proliferação, os dados atuais sugerem um papel estimulador combinado de ERα e AR na próstata, enquanto ERß inibe a proliferação e estimula a diferenciação. Tanto o estrogênio ERα quanto o ß têm afinidade pelo estradiol, enquanto os fitoestrógenos e o 3ßAdiol ativam seletivamente o ERß. Os fitoestrógenos devem, como resultado, ser capazes de restringir o crescimento do câncer, agindo como substitutos do 3ßAdiol. Isso é confirmado por estudos experimentais.

Os resultados de estudos de intervenção anteriores forneceram resultados promissores, indicando que certas modificações na dieta ou no estilo de vida podem influenciar a progressão do câncer de próstata, embora a maioria desses estudos tenha sido de duração bastante curta e baseada em números relativamente pequenos de pacientes. Por exemplo, um estudo randomizado mostrou que os homens que receberam uma adição dietética de sementes de linhaça tiveram uma porcentagem menor de células positivas contendo o marcador de proliferação Ki-67 do que os homens que não receberam essa adição à sua dieta. Em conjunto, as evidências atuais apontam para a possibilidade de pacientes com câncer de próstata complementarem com alternativas de tratamento relacionadas ao estilo de vida para prevenir ou retardar a progressão do tumor.

Objetivo específico: Realizar um estudo randomizado controlado de intervenção dietética em homens com câncer de próstata. Os investigadores perseguirão os seguintes objetivos específicos/hipóteses:

1. "Entre os homens com câncer de próstata de nível de risco intermediário, uma dieta rica em fitoestrógenos reduzirá a progressão do tumor em comparação com homens com uma dieta pobre em fitoestrógenos".
2. "Os efeitos de uma dieta rica em fitoestrógenos na progressão do tumor de câncer de próstata diferem entre homens com diferentes genótipos de polimorfismos no gene ERß". Os homens serão divididos em dois subgrupos, portadores dos alelos TT ou TC/CC, do polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) rs2987983-13950 T/C no gene ERß, nos quais a hipótese será testada.
3. Determinar se a expressão de RNA de AR, ERα e ERβ no tecido tumoral da próstata, bem como os níveis de hormônios esteróides, difere entre homens com uma dieta rica e pobre em fitoestrógenos, respectivamente, ou entre diferentes genótipos do gene ERβ.
4. Determinar se a expressão de mRNA de genes envolvidos na proliferação e vias de sinal de ER analisadas por perfil transcriptômico total em espécimes de prostatectomia difere entre homens com uma dieta rica e pobre em fitoestrógenos, respectivamente, ou entre diferentes genótipos do gene ERβ.

Protocolo do estudo: Por meio de médicos, os investigadores identificarão 240 homens na região de saúde de Västra Götaland que foram diagnosticados com câncer de próstata de nível de risco intermediário (T1-T2, pontuação de Gleason

Intervenção: Os pacientes serão apresentados à dieta de intervenção por um nutricionista e receberão informações gerais sobre escolhas alimentares saudáveis ​​(de acordo com as recomendações para o público em geral) e não devem ingerir suplementos alimentares, nenhuma outra restrição alimentar será fornecida. Os pacientes receberão um pacote contendo alimentos com alta quantidade de fitoestrógenos (≥100 mg de isoflavonoides e ≥100 mg de lignanas) que devem ser consumidos diariamente. A intervenção continua até o dia anterior à cirurgia (pelo menos 6 semanas). Os pacientes do grupo controle serão informados da mesma forma que os do grupo intervenção, exceto que não receberão nenhum pacote de alimentos.

Endpoint: O efeito da dieta na taxa de proliferação tumoral será medido fazendo comparações de 1) porcentagem de células positivas contendo o marcador Ki-67, 2) níveis de PSA, 3) expressão de genes envolvidos na proliferação e nas vias de sinal ER e expressão gênica de progressão do ciclo celular (CCP). Imediatamente após a cirurgia, o cirurgião coleta quatro biópsias de agulha mediana do espécime fresco da próstata, duas do local do tumor e duas do tecido saudável da próstata, com base em resultados anteriores das biópsias diagnósticas e ressonância magnética.Também na cirurgia , os tecidos da prostatectomia radical são coletados e fixados em formalina embebidos em parafina. Amostras de sangue serão coletadas no início do estudo, na véspera da cirurgia, e enviadas para análise de PSA (livre e total). As diferenças absolutas nos níveis de PSA e o tempo de duplicação do PSA serão calculadas. Além disso, os pesquisadores medirão a expressão de AR, ERα e ERß no tecido tumoral e os níveis sanguíneos de hormônios, testosterona, DHT, estradiol e 3ß-Adiol.

Questionário: Todos os pacientes responderão a um questionário protegido por senha na linha de base, cirurgia, peso e altura serão medidos. Uma vez durante o período de 6 semanas será realizada uma entrevista recordatória de 24 horas, na qual será registrada a ingestão alimentar dos participantes nas 24 horas anteriores. A ingestão individual de energia e nutrientes específicos será estimada vinculando as informações do questionário e registro da dieta ao banco de dados nutricional da Agência Nacional de Alimentos e nosso banco de dados de fitoestrógenos previamente desenvolvido. Informações sobre o possível uso de Finasterida, um inibidor da 5α-redutase, serão coletadas dos prontuários.

A análise de polimorfos:SNP no gene ERß será analisada em amostras de sangue, usando o método baseado em PCR PCR específico de alelo competitivo (KASP™). A constituição do alelo será identificada e os participantes serão alocados nos grupos TT, TC ou CC. Análise do Ki-67: A amostra da biópsia é fixada por imersão com paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M durante 24 horas a +4°C. Em seguida, é desidratado com etanol graduado seguido de xileno e inclusão em parafina. Os cortes de parafina são aquecidos por 30 minutos a 60ºC, pré-tratados com tampão de ácido cítrico. A ligação inespecífica é bloqueada por soro de burro em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo Triton X-100 por 30 minutos. Incubação com o anticorpo Ki-67 durante a noite (4ºC) seguida de incubação com o anticorpo secundário biotinilado apropriado. Para aumentar o sinal, as seções são tratadas com solução de complexo de avidina-biotina e, para visualizar a imunorreatividade, é usada a diaminobenzidina (DAB). As células tumorais coradas (positividade Ki-67) serão contadas e o resultado será relatado como a razão de núcleos positivos dividido pelo número total avaliado × 100.

Análise da expressão do receptor, pontuação do CCP, níveis hormonais e PSA: Amostras de tecido coletadas na cirurgia são colocadas em RNA posteriormente antes de serem congeladas. As amostras serão analisadas usando RNeasy plus Universal Mini Kits (QIAGEN) e reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. A expressão de ERα, ERβ e AR será determinada usando o ensaio TaqMan. O RNA total será extraído de seções fixadas em formol e embebidas em parafina de tumores e tecidos benignos usando o array de expressão global transcriptoma-wide Clariom ™ D (Thermos Fischer). Para análise do escore CCP, expressão gênica dos genes envolvidos no CCP com base no painel de genes Prolaris® e no Decipher Score, respectivamente. Os níveis sanguíneos de PSA serão analisados ​​de acordo com protocolo clínico padrão.

Cálculo do poder: Na região de saúde de Västra Götaland, em 2012, 321 homens tiveram câncer de próstata de nível de risco intermediário para o qual receberam tratamento curativo. O cálculo usando o resultado primário (Ki-67) fornece para um grupo de estudo composto por 118 pacientes um poder de 80% para um teste bilateral com um nível de significância de 0,05 e tamanho do efeito de 0,5. Os pesquisadores descobriram em estudos anteriores que aproximadamente 42% da população masculina são heterozigotos ou homozigotos para o alelo variante (TC/CC) da região promotora de ERβ SNP (rs2987983-13950 T/C) e 58% homozigotos para o alelo selvagem (TT). Uma vez que os investigadores esperam que o efeito da intervenção seja maior entre os indivíduos com o alelo variante, enquanto menor entre os indivíduos com o alelo do tipo selvagem, este último grupo deve ser grande o suficiente para ser capaz de encontrar uma diferença, se houver. Assim, é necessário um tamanho amostral total de 118/58%=203 pacientes.

Considerações estatísticas: Os investigadores utilizarão o método de intenção de tratar. No projeto e na coleta de dados, foram feitos testes de drogas conforme o modelo (randomização, placebo, cegamento, sem atrito, sem erros de medição diferencial, análise correta); para os desvios da situação perfeita, os investigadores usam a teoria epidemiológica para guiar as análises e interpretar os resultados. Análises preliminares, baseadas em médias, medianas, desvios padrão e intervalo interquantílico serão fornecidas para descrever adequadamente os desfechos de interesse e a estratificação será realizada para avaliar o desempenho da randomização da dieta designada. Box-plots serão, portanto, produzidos para avaliar graficamente as tendências temporais na resposta. A distribuição dos resultados será estudada e as transformações apropriadas serão aplicadas, se necessário, para melhorar a simetria e a normalidade. Devido à estrutura longitudinal dos dados, a correlação entre as observações será incorporada e modelos lineares de efeitos mistos serão realizados para estudar se (i) existe uma tendência temporal (ii) se a tendência linear difere entre indivíduos tratados e não tratados (iii ) se o efeito do tratamento entre o grupo intervenção e o grupo controle for modificado de acordo com os genótipos ERß, tanto para o comum quanto para o variante. Uma etapa fundamental na análise de dados longitudinais é identificar a estrutura de covariância apropriada que descreve as correlações entre os pontos de dados: covariância independente (sem correlação), covariância permutável (correlação igual) ou covariância autorregressiva com correlação entre respostas diminuindo com o tempo entre as medições. Os investigadores identificarão a estrutura mais adequada, verificada empiricamente com a ajuda de uma abordagem teórica da informação. Serão produzidos testes estatísticos e intervalos de confiança para avaliar a significância dos efeitos, procedimentos de teste F parcial serão, portanto, usados ​​para estudar o efeito conjunto de variáveis ​​principais e de interação e métodos estatísticos apropriados serão aplicados para estudar o ajuste do modelo. A associação entre ingestão de fitoestrógenos e proliferação de câncer será avaliada por modelos lineares generalizados, que fornecerão estimativas da diferença de risco (RDs) e correspondentes ICs de 95%, estratificados por genótipos ERβ. As interações entre a ingestão de fitoestrógenos e SNPs ERβ na proliferação serão avaliadas considerando escalas de efeito aditivo. Os grupos de ingestão de fitoestrógenos são incluídos como uma variável contínua, e cada SNP é representado por uma variável indicadora (variante ou não). A interação será avaliada em um modelo de probabilidade linear pelo termo do produto entre as covariáveis ​​que representam a ingestão de fitoestrógenos e os genótipos SNP.